Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen
Summary
This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.
Abstract
Analyse van een van de vitale functies van retinale pigmentepitheel (RPE) cellen, de fagocytose van verbruikte leeftijd distale fragmenten van fotoreceptor buitenste segmenten (POS) kan worden uitgevoerd in vitro. Fotoreceptor buitenste segmenten met stapels van membraneuze discs met de fototransductie machines worden continu vernieuwd in het netvlies. Doorgebracht POS worden dagelijks geëlimineerd door RPE cellen. Knaagdier, varken / rund en humane RPE cellen herkennen POS uit verschillende soorten op dezelfde wijze. Voor het uitvoeren grote reeks experimenten met weinig variabiliteit vergemakkelijken kan een grote voorraad POS worden geïsoleerd uit varkens ogen en opgeslagen in aliquots ingevroren. Dit protocol maakt gebruik van de eigenschap van photopigments die een oranje kleur weergegeven bij bewaring in het donker. Onder gedimd rood licht, zijn retinae opgevangen in een buffer uit geopende oogschelpen gesneden in helften. De retinale cel suspensie wordt gehomogeniseerd, gefiltreerd en geladen op een continue sucrose gradiënt. Na centrifugation, POS wordt in een afzonderlijke band in het bovenste deel van de gradiënt die een karakteristieke oranje kleur heeft. POS worden vervolgens verzameld, gesponnen, geresuspendeerd opeenvolgend in wasbuffers, geteld en in porties verdeeld. POS verkregen die wijze kan worden gebruikt voor fagocytose assays en analyse van eiwitten activatie lokalisatie of interactie op verschillende tijdstippen na POS challenge. Als alternatief kan POS gelabeld worden met fluoroforen, e. G., FITC, voordat aliquoting voor volgende fluorescentie kwantificering van POS binden of afblazen. Andere mogelijke toepassingen omvatten het gebruik van gemodificeerde POS of POS uitdaging gecombineerd met stressomstandigheden het effect van oxidatieve stress of veroudering op RPE cellen te bestuderen.
Introduction
In de retina, wordt zicht veroorzaakt door isomerisatie van fotogevoelige moleculen genaamd opsins, alvorens te worden omgezet in een signaal dat tussen neuronen kunnen worden doorgegeven aan de visuele gebieden van de hersenen. Deze moleculen zijn ingebed in stapels van membraneuze schijven lijkt op pannenkoeken dat de buitenste segment delen van lichtgevoelige cellen (PV's) vormen. Worden onderworpen aan een constante blootstelling aan licht en dus een aanzienlijke mate van oxidatieve stress, continu PR's hun buitenste segmenten te vernieuwen om mogelijke oxidatieve schade te beperken. Fotoreceptor buitenste segmenten staan in nauw contact met de apicale microvilli van het naburige retinale pigment epitheel (RPE) cellen. RPE-cellen vormen het buitenste gedeelte van de bloed-retina barrière en zorgen talrijke taken die cruciaal zijn voor fotoreceptoren gezondheid en functie 1 zijn, zoals afschrikken lichtstralen via melanine, opnieuw isomerisatie van de fotoreactieve opsin component retinal verstrekken van voedingsstoffen en gGROEI factoren, deelnemen aan PR metaboliet beschikking.
Bovendien elimineren RPE cellen besteed POS en hun componenten, een dagelijkse bezigheid die wordt gereguleerd door het circadiane ritme in zoogdierretina 2,3 recyclen. De klaring van loods POS is absoluut noodzakelijk voor PR overleven. Wanneer deze volledig is ingetrokken, POS vuil ophopen en PR's ontaarden dat een snel verlies van het gezichtsvermogen 4,5. Als de ritmische profiel verloren en vervangen door een constante activiteit, PR en RPE gebreken accumuleren 6 leeftijd. Daarom is het erg belangrijk om de moleculaire regulatie van RPE fagocytose karakteriseren in vitro om fenotypen verbonden met de dysfunctie begrijpen. Interessant is dat de moleculaire machinerie van RPE cellen vergelijkbaar met die gebruikt door macrofagen apoptotische cellen wissen en beide zijn afhankelijk erkenning van blootgestelde fosfatidylserine op fagocyterende vuil 7-9. Toch RPE cellen en macrofagen reguleren phagocytosis anders macrofagen kiezen voor onmiddellijke verwijdering van apoptotische cellen bij ontmoeting moment tijdens RPE cellen ritmisch overspoelen POS eenmaal daags ondanks hun permanent contact met de buitensegmenten. Dit suggereert specifieke mechanismen regelgeving die nog niet volledig begrepen.
Veel moleculen betrokken bij het RPE fagocytaire machine geïdentificeerd of gevalideerd door het gebruik van geïsoleerde POS en celcultuur fagocytose assays. De alphavbeta5 integrine receptor bij het RPE apicale celoppervlak, in samenwerking met zijn ligand MFG-E8, bindt specifiek aan POS 10-12, die vervolgens worden geïnternaliseerd via MerTK tyrosine kinase receptor 13-15. De CD36 scavenger receptor werd aangetoond dat POS inname en beïnvloeden de snelheid 16,17 en kan dienen als een sensor van geoxideerde fosfolipiden op het POS vlak 18. Internalisatie moet de werving van F-actine cytoskelet-associated eiwitten zoals annexine 2 19, myosine II 20 en myosine VIIA 21,22. Inheemse of geoxideerd POS in vitro worden ook gebruikt om veroudering fenotypes van RPE cellen in vivo gekoppeld aan accumulatie van slecht verteerd geoxideerde POS 23-28 begrijpen. Het genereren van RPE cellen afkomstig van stamcellen is een nieuwe toepassing voor geïsoleerde POS die worden gebruikt om de functies van cellen bewijzen voordat ze worden getransplanteerd dieren of patiënten 29,30,27 geïnitieerd.
Eerst beschreven door Molday en collega's in 1987 31, het protocol voor isolatie van runderen POS combineert een ultracentrifuge stap van retinale homogenaten op continue sucrosegradiënten met observatie van de karakteristieke oranje uiterlijk van ongebleekt retinale photopigment (uitvoeren 11- cis retinal). In de afgelopen 10 jaar, als gevolg van voorzorgsmaatregelen genomen om het risico van de gekkekoeienziekte te minimaliseren, het gebruik van varkens ogen is geworden increasingly prominent. De hier beschreven protocol duidelijk dat grote hoeveelheden POS van varkens of runderen ogen die kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen voor langere tijd te verkrijgen. Dit elimineert de noodzaak om POS bereiden van knaagdieren ogen, die vereist het gebruik van een groot aantal dieren per POS voorbereiding en test 32,33,21,22. Daarnaast worden gegevens over POS labeling vóór opslag met fluorescerende moleculen gegeven, te kwantificeren en visualiseren POS in een vereenvoudigde en vergelijkbare wijze voor sommige toepassingen tegenover etikettering POS na fagocytose assay 32,10. Daarom zijn deze grote voorraden zorgen voor reproduceerbaarheid en gebruiksgemak in vele verschillende experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drie stappen of omstandigheden cruciaal voor een optimale zuivering kwaliteit gradiënt gieten en delicate gradiëntbuizen manipulatie, waardoor weefsels gekoeld en in het donker totdat de verzamelstap, sterkte schudden van retinale homogenaten de juiste POS isolatie verkrijgen van de rest van de PR cel. Als sommige problemen zich voordoen in de juiste zien van de oranje band, ze zijn het meest waarschijnlijk te wijten aan één van de drie bovenstaande redenen (zie ook de tweede paragraaf van de Resultaten).</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs naar EVK), Fondation Voir et Entendre en Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Grants naar EVK), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, permanente positie voor EVK) , en The National Eye Institute van de National Institutes of Health (R01-EY13295 om SCF). Bovendien, het Institut de la Vision wordt gefinancierd door het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Parijs 6, Centre National de la Recherche Scientifique en afdeling de Paris.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2-chamber gradient maker | gradient maker with 30-ml chambers | ||
| 3-mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| small size magnetic stir bar | stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| red safelight lamp | inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25×89 cm tubes | Beckman | 344058 | ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30-mL centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| dark ice buckets with lids | |||
| scales | |||
| magnetic stirrer and upholding pole | |||
| refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| labcoat | Health and safety | ||
| gloves | |||
| sleeve protectors | |||
| googles | |||
| absorbent pads | |||
| biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades) | Dissection | ||
| 15-cm plastic dish | |||
| sterile gauze sheets | |||
| 15- and 50-mL tubes | Common consumables | ||
| microtubes | |||
| aluminum foil | |||
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
