Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

Summary

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Abstract

Análise de uma das funções vitais do pigmento epitelial da retina (RPE) células, a fagocitose de fragmentos distais envelhecido gasto de segmentos externos de fotorreceptores (POS) pode ser realizado in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos com pilhas de discos membranosos que contêm as máquinas phototransduction é continuamente renovado na retina. Passado POS são eliminados diariamente por células RPE. Roedor, suíno / bovino e células RPE humanas reconhecem POS a partir de várias espécies de um modo semelhante. Para facilitar a realização de uma grande série de experiências com pouca variabilidade, um grande stock de POS podem ser isolados a partir de olhos de porcos e armazenado congelado em alíquotas. Este protocolo tira proveito da característica de photopigments que exibem uma cor laranja quando mantidos no escuro. Sob a luz vermelha ofuscante, retinae são coletados em um buffer de viseiras abertas cortadas em metades. A suspensão de células da retina é homogeneizada, filtrada e carregado num gradiente de sacarose contínuo. Após centrifugation, POS estão localizados em uma banda discreta na parte superior do gradiente que tem uma cor laranja característica. POS são então recolhidas, centrifugadas, ressuspensas em tampões de lavagem sequencialmente, contadas e aliquotadas. POS obtidos deste modo podem ser utilizadas para ensaios de fagocitose e análise de activação da proteína, localização ou interacção em vários momentos após o desafio POS. Alternativamente, POS podem ser marcados com fluoróforos, e. G., FITC, antes de alíquotas para posterior quantificação de fluorescência de ligação de POS ou imersão. Outras aplicações possíveis incluem o uso de POS ou POS desafio modificado combinado com condições de estresse para estudar o efeito do estresse oxidativo ou envelhecimento sobre células RPE.

Introduction

Na retina, a visão é desencadeada por isomerização de moléculas fotossensíveis chamados opsinas, antes de ser transformado em um sinal que pode ser transmitido entre os neurónios para cima para as áreas visuais no cérebro. Estas moléculas são incorporados em pilhas de discos que se assemelham panquecas membranosas que constituem as partes segmentares exterior de células fotorreceptoras (RP). Sendo submetido a constante exposição à luz e, portanto, os níveis consideráveis ​​de estresse oxidativo, PRs renovar continuamente os seus segmentos externos para limitar o dano oxidativo potencial. Segmentos externos fotorreceptoras estão em contato próximo com microvilosidades apical das células do epitélio pigmentado da retina vizinhos (RPE). Células RPE constituem a parte exterior da barreira hemato-retiniana e garantir inúmeras tarefas que são cruciais para fotorreceptores saúde e função ^1, como o que extingue os raios de luz através de pigmentos de melanina, re-isomerização do retinal componente opsina fotorreactivo, fornecendo nutrientes e gCRESCIMENTO fatores, participando de eliminação PR metabólito.

Além disso, as células de RPE eliminam gasto POS e reciclar seus componentes, uma ocupação diária, que é regulada pelo ritmo circadiano na retina de mamíferos ^2,3. A folga de galpão POS é absolutamente necessário para a sobrevivência PR. Quando ele está completamente revogada, POS detritos se acumulam e PRs degenerar causando ^4,5 perda de visão rápida. Se o perfil rítmico é perdida e substituída por uma actividade constante, defeitos PR e RPE acumular com ⁶ anos ^de idade. Portanto, é muito importante para caracterizar a regulação molecular de EPR fagocitose in vitro, a fim de compreender fenótipos ligados à sua disfunção. Curiosamente, a maquinaria molecular em células RPE é muito semelhante à utilizada pelos macrófagos para eliminar as células apoptóticas e ambos dependem do reconhecimento de fosfatidilserina exposta em detritos fagocítica ^7-9. Ainda, as células de RPE e macrófagos regular o pHagocytosis de forma diferente, como macrófagos optar pela eliminação imediata das células em apoptose em tempo de encontro, enquanto as células RPE ritmicamente engolfar POS apenas uma vez por dia, apesar de estarem em contato permanente com segmentos externos. Isto sugere mecanismos de regulação específicos que ainda não são totalmente compreendidos.

Muitas das moléculas envolvidas na maquinaria de EPR fagocítica foram identificados e validados graças à utilização de POS isolado e ensaios de fagocitose de cultura de células. O receptor de integrina alphavbeta5 localizado na superfície apical de células RPE, em coordenação com o seu ligando MFG-E8, liga-se especificamente ao POS ^10-12, que são então internalizado através do receptor tirosina-quinase MerTK ^13-15. O scavenger receptor CD36 tem sido mostrado para participar na ingestão de POS e influenciar a sua velocidade de ^16,17, e poderá servir como um sensor de fosfolípidos oxidados na superfície POS ^18. Internalização precisa o recrutamento de F-citoesqueleto de actina-assproteínas, tais como a anexina ociated 2 ^{19, 20} e miosina II miosina VIIA ^21,22. POS Native ou oxidado in vitro também são utilizados para entender o envelhecimento fenótipos de células RPE in vivo ligados ao acúmulo de mal digeridos POS oxidado ^23-28. A geração de células epiteliais pigmentares derivadas de células-tronco deu início a uma nova aplicação para o isolado POS que são usados ​​para provar a funcionalidade das células antes de serem transplantadas para animais ou pacientes ^29,30,27.

Descrita pela primeira vez por Molday e colegas em 1987, ^31, o protocolo para o isolamento de POS bovina combina um passo ultracentrifugação de homogeneizados de retina em gradientes de sacarose contínuas com observação da aparência laranja característico de fotopigmento retinal crus (levando 11- retinal cis). Nos últimos 10 anos, devido a precauções tomadas, a fim de minimizar o risco de doença da vaca louca, o uso de olhos de porco tornou-se increasingly proeminente. O protocolo aqui descrito mostra como obter grandes quantidades de POS de porcina ou bovina olhos que podem ser distribuídos em alíquotas e armazenados por longos períodos de tempo. Isto elimina a necessidade de preparar a partir de POS de roedores olhos, o que exige a utilização de um grande número de animais em cada preparação e ensaio de POS ^32,33,21,22. Além disso, detalhes sobre rotulagem POS antes de armazenamento utilizando moléculas fluorescentes são dadas, para quantificar e visualizar POS de uma forma simplificada e comparáveis ​​para algumas aplicações, em comparação com a rotulagem POS após o ensaio de fagocitose ^32,10. Portanto, estes grandes existências permitir a reprodutibilidade e facilidade de utilização, em muitos tipos diferentes de experiências.

Protocol

Este experimento isolamento POS é demorado e pode precisar de até 12 horas para ser concluído se POS são rotulados antes do armazenamento. O protocolo foi adaptado de um artigo publicado pelo RS Molday e colegas em 1987, 31 e modificado por SC Finnemann e colegas em 1997 10. Os animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Os protocolos foram revisados…

Representative Results

A combinação do gradiente linear de sacarose e a ultracentrifugação permite a separação dos diferentes componentes da suspensão da retina por densidade. As células de RPE e detritos pesados ​​maior da retina para afundar ou perto do fundo do gradiente (Figura 2A). Isqueiro POS e células mais leves individuais ou detritos celulares a partir da retina migram como bandas distintas para alcançar o topo da metade do gradiente até ao final do período de centrifugação. Ao manter os olhos e as…

Discussion

Três degraus ou condições são cruciais para uma purificação optimizado: qualidade da carcaça de gradiente e manipulação delicada tubos de gradiente, mantendo tecidos refrigerada e no escuro até que o passo de recolha, a força de agitação de homogenatos da retina para se obter o isolamento POS adequado do restante da PR célula. Se algumas questões surgem em ver a banda laranja corretamente, eles são provavelmente devido a uma das três razões acima (ver também o segundo parágrafo da seção Res…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Specific Material/Equipment
2-chamber gradient maker			gradient maker with 30-ml chambers
3-mm diameter silicone tubing			tubing for gradient casting
small size magnetic stir bar			stir bar fitting the gradient maker chamber
red safelight lamp			inactinic lamp for dissection in the dark
Ultra Clear 25×89 cm tubes	Beckman	344058	ultracentrifugation tubes
PP Oak Ridge tubes	Nalgene	3119-0050	30-mL centrifugation tubes
Optima LE-80K	Beckman Coulter	365668	ultracentrifuge
SW 32Ti swing rotor	Beckman Coulter	369694	swing rotor for ultracentrifuge
Avanti J-26 XP	Beckman Coulter	393124	centrifuge
JA-25.50 rotor	Beckman Coulter	363058	rotor for Avanti J-26 XP centrifuge
FITC Isomer I	Life Technologies	F-1906	fluorescent dye
Other Material/Equipment
counting chamber (such as Neubauer or Malassez)
dark ice buckets with lids
scales
magnetic stirrer and upholding pole
refrigated microcentrifuge
37 °C water bath
-80 °C freezer
Consumables
labcoat			Health and safety
gloves
sleeve protectors
googles
absorbent pads
biohazard trash bags and bins
Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)			Dissection
15-cm plastic dish
sterile gauze sheets
15- and 50-mL tubes			Common consumables
microtubes
aluminum foil