זיהוי של<em> באתר</em> מכלולי חלבון-חלבון ב<em> דרוזופילה</em> הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay
Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.
Abstract
Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.
Introduction
תסיסנית דיסקים גדולים (DLG) הוא חבר של המשפחה שמורה kinase guanylate קרום הקשורים פיגומי חלבונים המסייעים לתזמר את ההרכבה של קומפלקסי חלבונים גדולים באתרים ספציפיים של קרום הפלזמה. זוהה במקור כחלבון מדכא סרטן, DLG משמש כגורם חשוב 1,2,3 קוטביות apicobasal אפיתל. DLG משמש גם כמודול פיגומים גדול בצומת העצבית-שהרירית (NMJ) של הנוירונים מוטוריים glutamatergic במהלך התפתחות זחל 4. DLG משחק תפקידים מגוונים בNMJ הזחל, וpleiotropism מסתמך על יכולתו לקשר עם חלבונים מרובים 5,6. חלבון אחד כזה הוא שאו הו-לי טאי (HTS), homologue לadducins היונקים שתוארו בעיקר בכל הקשור לתפקידם בויסות תקטין spectrin שלד תא 7. זה בעבר הוכח כי DLG וHTS יכולים ליצור קומפלקס אחד עם השני על בסיס במבחנה </em> שיתוף immunoprecipitation ניסויים מעורבים lysates לטוס כל המבוגר 8. חסרון אחד של תוצאות אלה, עם זאת, הוא שהם לא מציינים היכן צורות מורכבות זו. עם השימוש באימונוהיסטוכימיה, ההפצות של DLG וHTS הם נצפו לחפיפה בקרום postsynaptic של NMJs זחל, אבל הם במתחם באזור זה 8? כפי שניתן לראות לאחרונה ומפורט יותר כאן, הקירבה קשירת Assay (PLA) משמש כדי לחפש בשיתוף אתרו בין DLG וHTS במיוחד בNMJ זחל 27.
PLA הוא טכניקה חדשה יחסית המשמשת בעיקר בתרבית תאים ורקמות שיכולות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתר 9. ב assay זה, נוגדנים עיקריים נגד שני החלבונים של עניין מזוהים עם זוג של נוגדנים משני מינים ספציפיים, המכונה בדיקות PLA, אשר מצומדת לoligonucleotides (איור 1 א ', ב'). אם שני החלבוניםים נמצא בסמיכות זה לזה (כלומר בתוך כמה עשרות ננומטרים), ניתן לגשר על המרחק בין בדיקות PLA המצורפות באמצעות הכלאה של שני oligonucleotides נוסף מחבר (איור 1 ג). בקונפורמציה זו, מסתיימת ללא oligonucleotides המחבר קרוב מספיק כדי ליצור קשר אחד עם השני, ומולקולת DNA מעגלית סגורה יכולה להיווצר עליו בקשירה באתרו (1D איור). מולקולת ה- DNA המעגלית משמשת כתבנית באתר הגברה המעגל מתגלגל, אשר ערוכה על ידי אחד מoligonucleotides המוצמד לבדיקות PLA (איור 1E). רצפים בתוך מוגבר מוצר ה- DNA וכתוצאה מכך, concatemeric אז יכולים להיות דמיינו עם, בדיקות שכותרתו fluorescently משלימות oligonucleotide (איור 1F). מאז DNA המוגבר נשאר מחובר לאחד מבדיקות PLA, לוקליזציה subcellular של withi האינטראקציה בין חלבוניםרקמת na אפשר ללמוד בקלות.
כמה שיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון כוללים בטכניקות חוץ גופית כגון שיתוף immunoprecipitation, הנפתח מבחני והקרנת שתי היברידית שמרים, ובטכניקות vivo כגון העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) וbimolecular פלואורסצנטי שלמה ( BiFC). מלכודת של הטכניקות במבחנה היא שהם אינם מזדהים בו האינטראקציה מתרחשת באופן אנדוגני, בעוד vivo טכניקות האמורות בלערב את הביטוי המלאכותי של חלבוני היתוך שעלול שלא לשקף התנהגות יליד עמיתי אנדוגני. אחד יתרונות עיקריים של PLA הוא שהוא מסוגל לקבוע בתוך רקמת לוקליזציה subcellular של interactors חלבון אנדוגני שנמצאים בסמיכות זה לזה, וסביר להניח להרכיב מורכב, עם מידת הקרבה הדרושה כדי ליצור אות להיות דומה לFRET וBiFC. PLA יכול לזהות אינטראקציות עם סגוליות גבוהות ורגישות בשל הצימוד של הכרת נוגדן והגברת DNA. לפיכך, assay יכול ליצור אותות בדידים, בהירים בצורה של puncta החושפות את עמדתה של האינטראקציה המדויקת. בנוסף, ניתן לאתר אנטיגנים בקושי נראים לעין. לבסוף, PLA הוא טכניקה פשוטה יחסית לביצוע, וזה לוקח לא יותר מהליך immunohistochemical סטנדרטי כדי להשלים. לכן, PLA מספק יתרון טכני על מבחני אינטראקציה אחרים חלבון-חלבון שלעתים קרובות נגועים בזמני הכנה ארוכים ופתרון בעיות נרחבות.
פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני באתר. כאן, PLA מבוצע על הכנות שריר זחל קיר גוף שבו DLG וHTS מוצגים לאכן מתקיימים במתחם באזור postsynaptic של NMJs. PLA לא היה בשימוש בעבר כדי ללמוד את NMJ הזחל, ויש כיום רק קומץ של מאמרים שפורסמו שהשתמשו assay זה ברקמת דרוזופילה. יש לקוות כי חשיפה נוספת של PLA לקהילת תסיסנית תגרום שימוש ככלי נוסף הגדיל אותו כדי להשלים את מבחני אחרים, נפוצים יותר חלבונים אינטראקציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו"ח זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ. Assay מבוצע על הכנות שריר קיר גוף זחל לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני נוכחים בNMJ. בעזרת טכניקה זו, DLG וHTS מוצגים להיות בסמיכות זה לזה, ובכך קיימים במתחם, במיוחד באזור postsynaptic 27. בתמיכה של תוצאה זו, מח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לתסיסנית מרכז Stock Bloomington למתן מניות זבוב. אנו מודים גם לבנק התפתחותית המחקרים Hybridoma וד"ר לין קולי (אוניברסיטת ייל) למתן נוגדנים. תודה מיוחדת לAhHyun Yoo על עזרתה בכתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (קריגר), ויליאם ועדה איזבל פלדת הקרן (קריגר), והמכון הקנדי לחקר בריאות (הרדן).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. . Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
