の検出<em>その場で</emで>タンパク質 - タンパク質複合体<em>ショウジョウバエ</em近接ライゲーションアッセイの使用>幼虫神経筋接合部
Summary
このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。
Abstract
Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.
Introduction
（Dlgという）大ショウジョウバエディスクは、原形質膜の特定の部位での大きなタンパク質複合体の集合を編成助ける足場タンパク質の膜結合グアニル酸キナーゼファミリーの保存されたメンバーである。腫瘍抑制タンパク質は、Dlgという上皮apicobasal極性1,2,3の重要な決定因子として機能するように最初に同定された。 DLGはまた幼虫の発育4中のグルタミン酸作動性運動ニューロンの神経筋接合部（NMJ）での主要な足場モジュールとして提供しています。 DLGは幼虫NMJでの多様な役割を果たし、その多面発現は、複数のタンパク質5,6と会合する能力に依存しています。このようなタンパク質の1つは、胡-LIの太極拳シャオ（HTS）、主にアクチンスペクトリン細胞骨格7の調節における役割に関してに記載されている哺乳類adducinsにホモログである。これは、以前には、Dlgおよびフーバー、インビトロに基づいて、互いに複合体を形成することができることが示されている</em>の全体の大人のフライ溶解物8を含む共免疫沈降実験。これらの結果の一つの欠点は、しかし、それらはここで、この複合体の形態を示すものではないということである。免疫組織化学を使用することにより、Dlgというおよびフーバーの分布は、幼虫のNMJのシナプス後膜にオーバーラップすることが観察されますが、この領域8で複合体中にありますか？最近示されており、ここでさらに詳述されるように、近接ライゲーションアッセイ（PLA）は、幼虫のNMJ 27で特異的には、Dlgとフーバーの間にその場での関連で検索するために使用されます。
PLAは、主にその場 9 でのタンパク質-タンパク質相互作用を検出することができ、細胞および組織培養に使用される比較的新しい技術である。このアッセイでは、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体は、種特異的二次抗体の対を用いて検出される、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたPLAプローブと呼ばれる（ 図1A、B）。 2タンパク質の場合sは、添付のPLAのプローブ間の距離は、2つの追加のコネクターオリゴヌクレオチド（ 図1C）のハイブリダイゼーションを介してブリッジすることができる（数十ナノメートル以内すなわち ）は、互いに近接している。この立体配座において、コネクタオリゴヌクレオチドの自由端が互いに接触するのに十分近く、閉じた環状DNA分子は、in situ ライゲーション （ 図1D）に基づいて形成することができる。環状DNA分子は、PLAプローブ（ 図1E）にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドのいずれかによって準備され、その場でのローリングサークル増幅のための鋳型として働く。得られた増幅、コンカテマーDNA産物内の配列は、次いで、蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブ（ 図1F）で可視化することができる。増幅されたDNAは、PLAプローブの1つは、タンパク質 – タンパク質相互作用withiの細胞内局在に付着したままであるので組織ナ容易に確認することができる。
いくつかの方法は、一般に、共免疫沈降、プルダウンアッセイおよび酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのインビトロ技術において 、そのようなフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）と二分子蛍光相補性（のようなインビボ技術を含むタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために使用されるBIFC）。 インビトロ技術の落とし穴は、相互作用が内生的に発生している場所で 、前述のインビボ技術は、それらの内因性の対応のネイティブ動作を反映していない可能性が融合タンパク質の人工的な発現を伴うながら、彼らは、特定していないということです。 PLAの1つの主な利点は、それがFRに匹敵する信号を生成するために必要な近さの程度と、組織内で互いに近接していると可能性が高い複合体を形成する内因性タンパク質の相互作用因子の細胞内局在を決定することができるということであるETとBIFC。 PLA起因抗体認識およびDNA増幅のカップリングに高い特異性と感度との相互作用を検出することができる。したがって、このアッセイは、相互作用の正確な位置を明らかに涙の形で個別の、明るい信号を生成することができる。また、ほとんどの可視抗原を検出することができる。最後に、PLAは、実行する比較的簡単な技術ではない、それが完了するために、標準的な免疫組織化学的手順よりも、もはやかかる。従って、PLAは、多くの場合、長い準備時間と広範なトラブルに悩まされている他のタンパク質 – タンパク質相互作用アッセイを介して技術的な利点を提供する。
このプロトコルは、PLAは、 その場での内因性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために、ショウジョウバエ幼虫NMJに適用することができる方法を示す。ここでは、PLAは、は、Dlgおよびフーバーが実際のNMJのシナプス後領域に複合体中に存在することが示されている幼虫の体壁筋調製物に対して行われる。 PLAは、以前に幼虫のNMJを研究するために使用されていなかった、とショウジョウバエの組織でこのアッセイを使用している論文のほんの一握りは、現状であります。これは、 ショウジョウバエコミュニティにPLAのさらなる暴露は、他のより一般的に使用されるタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを補完する追加のツールとしての利用増加につながることが期待されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポートは、PLAは、ショウジョウバエの幼虫NMJに適用する方法を示しています。アッセイは、NMJで存在する内因性のタンパク質 – タンパク質相互作用を検出するため幼虫体壁筋調製物に対して行われる。この技術では、は、Dlgおよびフーバーは、互いに近接しているため、特にシナプス後領域27において、複合体中に存在することが示されている。この結果を支持して、以…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ハエの株式を提供するためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝します。我々はまた、抗体を提供するための発達研究ハイブリドーマバンク博士リン·クーリー（エール大学）を感謝。特別な感謝は、原稿上で彼女の助けをAhHyunユに行く。この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会（クリーガー）、ウィリアムとエイダイザベルスチール基金（クリーガー）、およびカナダ衛生研究所（ハーデン）からの補助金によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
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