Algılama<em> In Situ</emEn> Protein-protein kompleksleri<em> Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı> Larva Nöromüsküler Junction

Summary

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Büyük Drosophila Diskler (DLG), plazma membranının belirli bölgelerde büyük protein komplekslerinin montaj orkestra yardımcı proteinleri iskele ve zara bağlı guanilat kinaz ailesinin bir korunmuş üyesidir. Bir tümör baskılayıcı protein, Dlg epitel apicobasal polarite ^1,2,3 önemli bir belirleyicisi olarak hizmet gibi Başlangıçta belirledi. Dlg da larva gelişimi ⁴ sırasında glutamaterjik motor nöron nöromüsküler bileşke (NMJ) bir ana iskele modülü olarak hizmet vermektedir. Dlg larva NMJ farklı roller oynar ve onun pleyotropizm birden proteinler ^5,6 ile ilişkilendirmek için kendi yeteneklerine bağlıdır. Böyle bir protein, Hu-Li Tai shao (HTS), esas ^{olarak, 7} hücre iskeleti aktin-spektrin düzenlemedeki rolleri ile ilgili olarak tarif edilmiştir, memeli adducins bir homologudur. Daha önce Dlg ve Hts, in vitro göre birbirleri ile bir kompleks meydana getirebilir gösterilmiştir </em> Bütün yetişkin sinek lizatlarını ⁸ içeren ko-immünopresipitasyon deneyleri. Bu sonuçların bir eksiklik, ancak, bu karmaşık formlar göstermemektedir olmasıdır. Immünhistokimyasal kullanımı ile, Dlg ve Hts dağılımları larva NMJs postsinaptik membran üst üste görülmektedir, ancak bu bölgede ⁸ bir kompleks vardır? Son zamanlarda gösterilen ve daha burada ayrıntılı olarak, Proximity ligasyon Testi (PLA) larva NMJ ²⁷ de özellikle Dlg ve Hts arasındaki in situ dernek bir bakmak için kullanılır.

PLA çok yerinde ^9, protein-protein etkileşimlerini tespit edebilir, hücre ve doku kültürü içinde kullanılan nispeten yeni bir tekniktir. Bu deneyde, ilgi konusu iki protein karşı birincil antikor türe spesifik antikorlarla bir çift tespit edilir, oligonükleotidlere konjüge olduğu PLA problar olarak adlandırılan (Şekil 1A, B). İki protein halindes, bağlı PLA sondaları arasındaki mesafe iki ek bağlayıcı oligonükleotidler (Şekil 1C) melezlenmesi ile köprülenebilir (nanometre bir kaç on içindeki) birbirine yakın temas içindedir. Bu uyum, bağlayıcı oligonükleotidler serbest uçları, her biri bir diğeri ile temas için yeterince yakın olan ve bir kapalı dairesel bir DNA molekülü, in situ ligasyon (Şekil 1D) üzerine oluşturulabilir. dairesel bir DNA molekülü PLA probları (Şekil 1E) konjüge edilmiş oligonükleotidlerin bir kişi tarafından hazırlanmış olan yerinde yuvarlanan çember amplifikasyonu için bir şablon olarak hizmet vermektedir. Elde edilen çoğaltılmış, concatemeric DNA ürününün içinde sekanslar daha sonra floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotid prob (Şekil 1F) ile görselleştirilebilir. Yükseltilmiş DNA PLA problarının bir protein-protein etkileşimi withi hücre içi lokalizasyonu bağlı kalır yanana doku kolayca tespit edilebilir.

Çeşitli yöntemler yaygın olarak, ko-immünopresipitasyon olarak in vitro teknikler de dahil olmak üzere protein-protein etkileşimlerini tespit (-aşağı çekme deneyleri ve maya iki-hibrid eleme ve bu Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) ve Biyomoleküller Floresan tamamlama gibi in vivo teknikler kullanılır BiFC). In vitro teknikler hatadır etkileşimi endojen nerede oluştuğunu Anılan in vivo teknikleri kendi endojen meslektaşları yerli davranışını yansıtmıyor olabilir füzyon proteinlerinin yapay ifadesini içerir iken onlar, tespit kalmamasıdır. PLA bir avantaj da FR karşılaştırılabilir olan bir sinyal üretmek için gerekli olan yakınlık derecesine sahip, bir doku içinde, birbirine çok yakın olan ve büyük olasılıkla bir kompleks oluşturan endojen protein uygulayıcı hücre içi lokalizasyonu belirleme kapasitesine sahip olmasıdırET ve BiFC. PLA nedeniyle antikor tanıma ve DNA amplifikasyonu bağlanması yüksek özgüllük ve duyarlılık ile etkileşimleri algılayabilir. Böylece, tahlil etkileşim kesin konumunu ortaya puncta şeklinde ayrık, parlak sinyaller üretebilir. Buna ek olarak, zor görülen antijenler tespit edilebilir. Son olarak, PLA gerçekleştirmek için nispeten basit bir tekniktir ve tamamlamak için standart bir immünohistokimyasal prosedürde daha uzun sürer. Bu nedenle, PLA genellikle uzun hazırlık süreleri ve kapsamlı sorun giderme ile boğulmuş diğer protein-protein etkileşimleri deneyleri üzerinde bir teknik avantaj sağlar.

Bu protokol, PLA yerinde endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Burada, PLA Dlg ve Hts gerçekten NMJs postsinaptik bölgede bir kompleks var olduğu gösterilmiştir larva vücut duvarı kas hazırlıkları yapılır. PLA önce larva NMJ incelemek için kullanılan olmamıştır, ve Drosophila dokusunda bu testte kullandık yayınlanan bildiri sadece bir avuç şu anda vardır. Bu Drosophila topluma PLA daha pozlama başka, daha yaygın olarak kullanılan protein-protein etkileşimleri deneyleri tamamlamak için ek bir araç olarak artan kullanımı neden olacağı ümit edilmektedir.

Protocol

1. Vücut Duvar Hazırlık . NOT: Daha önce Brent ve arkadaşları 10, ya da Ramachandran ve Budnik ağacının 11,12 tarif edildiği gibi (vücut duvarı kasları innerve NMJs bir çalışma için), üçüncü evre larvaların gövde duvarları hazırlanması ancak bazı tadilatlar ile, gerçekleştirildi. Teşrih Standart prosedürler kullanılarak 13 beş-altı gün boyunca 25 ° C'de sinek stokları ve haçlar ka…

Representative Results

Yabani tip Üçüncü dönem larva NMJs ise, Dlg ağırlıklı tipi boutons mı daha Dlg immünoreaktivite düzeyleri tip Ib boutons daha belirgin olmak, tip I glutamaterjik boutons postsinaptik membranda bulunan (Şekil 3A) 4. Hts kas boyunca mevcut ama Hts immünoreaktivite düzeyleri hem tip I boutons eşit görünen ile postsinaptik bölgede yoğunlaşır ve aynı zamanda (Şekil 3A ') 8,17 presynaptically bulunur. Dlg ve Hts dağılımları ölçüde posts…

Discussion

Bu rapor PLA Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Deney NMJ endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla larva vücut duvarı kaslarında gerçekleştirilir. Bu teknik ile, Dlg ve Hts birbirine yakın olması ve bu nedenle, özellikle postsinaptik bölge ^27'de, bir kompleks içinde bulunması gösterilmektedir. Bu sonucun desteklemek, bir önceki çalışmada aşağıdaki verileri ile dernek kanıtlar sunmuştur: Dlg ve Hts immünoreaktif dağılımları larva N…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040