Påvisning av<em> In Situ</em> Protein-protein komplekser på<em> Drosophila</em> Larve Nevromuskulær Junction hjelp Proximity Ligation analysen

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan Proximity Ligation analysen kan brukes til å oppdage in situ protein-protein interaksjoner på Drosophila larvenevromuskulære krysset. Med denne teknikken, er plater store og Hu-li tai Shao vist seg å danne et kompleks på den postsynaptiske region, en forening tidligere identifisert gjennom ko-immunoutfelling.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Drosophila plater store (DLG) er en konservert medlem av membran-assosiert guanylat-kinase familien av stillaser proteiner som bidrar til å organisere montering av store proteinkomplekser på bestemte steder av plasmamembranen. Opprinnelig identifisert som en tumor suppressor protein, DLG tjener som en viktig determinant for epitelisk apicobasal polaritet ^1,2,3. DLG fungerer også som et stort stillas modul ved nevromuskulære krysset (NMJ) av glutamaterge motoriske nerveceller i løpet av larveutvikling ^fire. DLG spiller ulike roller på larve NMJ, og dens pleiotropism avhengig av sin evne til å assosiere med flere proteiner ^5,6. Et slikt protein er Hu-li tai Shao (HTS), en homolog til de pattedyr adducins som i hovedsak har vært beskrevet i forhold til sine roller i regulering av aktin-spektrin cytoskjelettet ^7. Det har tidligere blitt vist at DLG og Hts kan danne et kompleks med hverandre basert på in vitro </em> co-immunoutfellingsstudier forsøk med hel voksne fluelysatene ^8. En brist av disse resultatene, er imidlertid at de ikke indikere hvor dette komplekse former. Med bruk av immunhistokjemi, blir fordelingen av DLG og Hts observert å overlappe på den postsynaptiske membran av larve NMJs, men de er i et kompleks i denne regionen ^8? Som nylig vist og beskrevet nærmere her, er Proximity Ligation analysen (PLA) som brukes til å lete etter en in situ sammenheng mellom DLG og Hts spesielt på larve NMJ ^27.

PLA er en relativt ny teknikk som brukes for det meste i celler og vev kultur som kan oppdage protein-protein interaksjoner in situ ^9. I denne analyse, er primære antistoffer mot de to proteiner av interesse påvises med et par av artsspesifikk sekundære antistoffer, betegnet PLA prober, som er konjugert til oligonukleotider (figur 1 A, B). Hvis de to proteins er i umiddelbar nærhet til hverandre (dvs. i løpet av få titalls nanometer), idet avstanden mellom de vedlagte PLA prober kan slås bro over ved hybridisering av to ytterligere forbindelses oligonukleotider (figur 1C). I denne konformasjon, de frie ender av kontakt oligonukleotider er nær nok til å gjøre kontakt med hverandre, og et lukket, sirkulært DNA-molekyl kan dannes ved in situ-ligering (figur 1D). Den sirkulære DNA-molekyl som virker som et templat for in situ rullende sirkel forsterkning, som er fylt av en av de oligonukleotider som er konjugert til PLA-prober (figur 1E). Sekvenser i de resulterende amplifiserte, concatemeric DNA-produkt kan deretter bli visualisert med fluoresceinmerkede, komplementære oligonukleotid-prober (figur 1F). Siden det amplifiserte DNA forblir festet til en av PLA-sonder, den subcellulære lokalisering av protein-protein interaksjon withina vevet lett kan fastslås.

Flere metoder blir ofte brukt for å påvise protein-protein interaksjoner inkludert in vitro teknikker som co-immunoprecipitation, pull-down-analyser og gjær to-hybrid screening, og in vivo teknikker som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) og bimolecular Fluorescens Komplemente ( BiFC). En fallgruve av in vitro teknikker er at de ikke identifisere hvor samspillet er endogent forekommende, mens den tidligere nevnte in vivo teknikker involvere kunstig uttrykk for fusjonsproteiner som viser ikke nødvendigvis den opprinnelige atferden til sine endogene kolleger. En stor fordel med PLA er at den er i stand til å bestemme i en vev av subcellulære lokalisering av endogene protein interactors som er i umiddelbar nærhet til hverandre, og sannsynligvis danner et kompleks, med graden av nærhet nødvendig for å generere et signal som kan sammenlignes med FRET og BiFC. PLA kan detektere interaksjoner med høy spesifisitet og sensitivitet som følge av koplingen av antistoffgjenkjenning og DNA-amplifisering. Således kan analysen generere diskrete, lyse signaler i form av puncta som viser den nøyaktige plasseringen av interaksjonen. I tillegg kan knapt synlige antigener påvises. Til slutt, er PLA en relativt enkel teknikk for å utføre, og det tar ikke noe lenger tid enn en standard immunhistokjemisk fremgangsmåte for å fullføre. Derfor gir PLA en teknisk fordel over andre protein-protein interaksjons analyser som ofte plaget med lange forberedelser ganger og omfattende feilsøking.

Denne protokollen viser hvordan PLA kan anvendes til Drosophila larve NMJ for det formål å detektere endogene protein-proteininteraksjoner in situ. Her er PLA utført på larvekroppen veggmuskel preparater der DLG og Hts er vist å faktisk eksistere i et kompleks på den postsynaptiske regionen NMJs. PLA har ikke tidligere blitt brukt til å studere larve NMJ, og det er i dag bare en håndfull av publiserte artikler som har brukt denne analysen i Drosophila vev. Det er å håpe at ytterligere eksponering av PLA til Drosophila samfunnet vil resultere i sin økt bruk som et ekstra verktøy for å utfylle andre, mer vanlig brukte protein-protein interaksjons analyser.

Protocol

1. Body Wall Forberedelse MERK: Utarbeidelse av tredje stadium larve kroppens vegger (for studiet av NMJs som innerverer kroppen veggen muskler) ble utført som tidligere beskrevet i Brent et al 10, eller Ramachandran og Budnik 11,12, men med noen endringer.. Disseksjon Heve flue aksjer og kors ved 25 ° C i fem til seks dager ved hjelp av standard prosedyrer 13. Plukk kryp tredje stadium larver fra ampuller ell…

Representative Results

I villtype tredje stadium larve NMJs, er DLG hovedsakelig funnet på den postsynaptiske membran av type I glutamaterge boutons, med DLG immunoreaktivitets nivåer være mer uttalt hos type IB boutons enn type Er boutons (figur 3A) 4. Hts er til stede i hele muskelen, men konsentrerer seg på den postsynaptiske region med Hts immunoreaktivitets nivåer vises lik i både type I boutons, og er også funnet presynaptisk (figur 3A ') 8,17. Legg merke til at fordelin…

Discussion

Rapporten viser hvordan PLA kan anvendes til Drosophila larve NMJ. Analysen utføres på larvekroppsveggmuskelpreparater i den hensikt å detektere endogene protein-protein interaksjoner tilstede på NMJ. Med denne teknikk blir DLG og Hts vist seg å være i umiddelbar nærhet til hverandre, og således foreligge i en kompleks, spesielt på den postsynaptiske region ^27. Til støtte for dette resultatet, har en tidligere studie gitt bevis for sin forening med følgende data: 1) de immunoreaktive distr…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040