Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

Sommario

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Abstract

Discs large (Dlg) è un membro conservato della famiglia delle guanilato chinasi associate alla membrana e funge da principale proteina di impalcatura presso la giunzione neuromuscolare larvale (NMJ) in Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che la distribuzione postsinaptica di Dlg a livello della NMJ larvale si sovrappone a quella di Hu-li tai shao (Hts), un omologo degli adducini dei mammiferi. Inoltre, si osserva che Dlg e Hts formano un complesso tra loro sulla base di esperimenti di co-immunoprecipitazione che coinvolgono lisati di mosca adulti interi. A causa della natura di questi esperimenti, tuttavia, non era noto se questo complesso esistesse specificamente nel NMJ durante lo sviluppo larvale.

Il saggio di ligazione di prossimità (PLA) è una tecnica di recente sviluppo utilizzata principalmente in colture cellulari e tissutali in grado di rilevare le interazioni proteina-proteina in situ. In questo test, i campioni vengono incubati con anticorpi primari contro le due proteine di interesse utilizzando procedure immunoistochimiche standard. Gli anticorpi primari vengono quindi rilevati con una coppia appositamente progettata di anticorpi secondari coniugati con oligonucleotidi, denominati sonde PLA, che possono essere utilizzati per generare un segnale solo quando le due sonde si sono legate in stretta vicinanza l'una all'altra. Pertanto, le proteine che si trovano in un complesso possono essere visualizzate. Qui, viene dimostrato come il PLA possa essere utilizzato per rilevare le interazioni proteina-proteina in situ nella NMJ larvale di Drosophila. La tecnica viene eseguita su preparazioni muscolari della parete larvale del corpo per dimostrare che esiste effettivamente un complesso tra Dlg e Hts nella regione postsinaptica delle NMJ.

Introduzione

Drosophila dischi di grandi dimensioni (Dlg) è un membro conservato della guanilato famiglia chinasi associata alla membrana di ponteggi proteine ​​che aiutano a orchestrare l'assemblaggio di grandi complessi proteici in siti specifici della membrana plasmatica. Originariamente identificato come una proteina soppressore del tumore, Dlg serve come un importante determinante di epiteliale ^1,2,3 apicobasal polarità. Dlg serve anche come un importante modulo di ponteggio a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) dei motoneuroni glutamatergici durante lo sviluppo larvale ^4. Dlg svolge ruoli diversi al larvale NMJ, e la sua pleiotrop....

Protocollo

1. Preparazione parete Corpo

NOTA: Preparazione di terzo stadio larvale pareti corpo (per lo studio delle NMJs che innervano i muscoli della parete corpo) è stata eseguita come precedentemente descritto in Brent et al ^10, o Ramachandran e Budnik ^11,12, ma con alcune modifiche..

1. Dissezione
   1. Sollevare scorte mosca e croci a 25 ° C per 5-6 giorni usando procedure standard ^13.
   2. Scegli strisciando terzo instar larve di fiale o flaconi utilizzando una pinza sottile.
   3. Lavare le larve in un piccolo piatto di Petri contenente tampone fosfato salino (PBS) per ri....

Risultati

In wild-type terzo stadio larvale NMJs, Dlg è prevalentemente trova a livello della membrana post-sinaptica di tipo I boutons glutamatergiche, con livelli di immunoreattività Dlg essere più pronunciato in tipo IB boutons di tipo è boutons (figura 3A) ^4. Hts è presente in tutto il muscolo, ma si concentra in zona post-sinaptica con Hts livelli immunoreattività appare uguale in entrambi di tipo I boutons, ed è anche trovato presinapticamente (figura 3A ') ^8,17. Si no.......

Discussione

Questo rapporto dimostra come PLA può essere applicata alla Drosophila larvale NMJ. Il test viene eseguito su preparazioni muscolari parete corpo larvali al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogeni presenti al NMJ. Con questa tecnica, Dlg e HTS vengono mostrati per essere in stretta vicinanza l'uno all'altro, e pertanto esistere in un complesso, in particolare in corrispondenza della zona ²⁷ postsinaptico. A sostegno di questo risultato, un precedente studio ha fornito prove.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinze (fini #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mescolare la base elastomerica e l'agente indurente in un rapporto 10:1. Impostare per 30 min. Versare in uno stampo (es. utilizzare una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti). Lasciare indurire per almeno 24 ore. Far aderire il coperchio di una capsula di Petri da 60 x 15 mm durante la dissezione.
Spille per minuzie (0,0125  Forbici
	15200-00
Vetrini			Incollare due vetrini coprioggetti da 22 x 22 mm2 su un vetrino da microscopio con smalto trasparente, lasciando un < 20 mm di spazio tra loro per il montaggio del campione.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	stato ribilanciato su un bilanciatore GFP in modo che i mutanti omozigoti possano essere selezionati in base all'assenza di segnale GFP.
1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato): 3  mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Soluzione di Bouin	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldeide): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Scienza dell'Anachemia - 66194-300). Vedere doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 per istruzioni su come preparare la soluzione.
[header]
1x PBT (Soluzione Salina Tamponata con Fosfato con Triton): 1x PBS con 0,01% di Tritone			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Albumina Sierica Bovina): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Conservare a 4 °C.
topo anti-Dlg (Dischi grandi)	Studi sullo sviluppo Banca di ibridomi	4F3	Utilizzare a una diluizione 1:10 in 1% BSA.
coniglio anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Fornito dalla dottoressa Lynn Cooley (Università di Yale). Utilizzare alla diluizione 1:250 in 1% BSA.
coniglio anti-Pak (chinasi attivata da p21)			Fornito dal Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Utilizzare alla diluizione 1:500 in 1% BSA.
topo anti-Wg (senza ali)	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	4D4	Utilizzare a una diluizione 1:5 in 1% BSA.
capra anti-Hrp (rafano perossidasi)	Jackson                          ImmunoResearch	123-065-021	Uso a una diluizione 1:200 in BSA all'1%.
Asinino coniugato FITC-anti-capra	Jackson                       ImmunoResearch	705-095-003	Utilizzare a una diluizione 1:200 in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-coniglio PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink Reagenti per il rilevamento in situ Rosso	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0,01  M Tris, 0,15  M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Tampone di lavaggio B: 0,2  M Tris, 0,1  M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Tampone di lavaggio B: 2  mM Tris, 1  mM NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink Terreno di montaggio in situ con DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040

per microdissezione (ultra fine)Fine Science Tools per piattaforma Stock Center è