Detektion av<em> In situ</em> Protein-proteinkomplex på<em> Drosophila</em> Larv Neuromuskulära förbindelsen Använda Proximity Ligation Assay

Summary

Detta protokoll visar hur Proximity Ligation Assay kan användas för att upptäcka in situ protein-proteininteraktioner på Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen. Med denna teknik är Skivor stora och Hu-li tai shao visat att bilda ett komplex vid postsynaptiska regionen, en sammanslutning som tidigare identifierats genom co-immunoprecipitation.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Drosophila Skivor stora (Dlg) är en konserverad medlem av membranassocierat guanylat kinasfamiljen av byggnadsställningar proteiner som hjälper iscensätta montering av stora proteinkomplex vid specifika ställen i plasmamembranet. Ursprungligen identifieras som ett tumörsuppressorprotein, tjänar Dlg som en viktig faktor för epitelial apicobasal polaritet ^1,2,3. Dlg fungerar också som en viktig byggnadsställningar modul vid den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) av glutamaterga motoriska nervceller under larvutveckling ^4. Dlg spelar olika roller på larv NMJ, och dess pleiotropism förlitar sig på sin förmåga att associera med flera proteiner ^5,6. Ett sådant protein är Hu-li tai shao (HTS), en homolog till de däggdjurs adducins som främst har beskrivits i fråga om att deras roller i regleringen av aktin-spek cytoskelettet ^7. Det har tidigare visats att Dlg och Hts kan bilda ett komplex med varandra som bygger på in vitro </em> co-Immunutfällningsexperiment involverar hela vuxna flyga lysat ^8. En brist av dessa resultat, är emellertid att de inte anger där denna komplexa former. Med användning av immunohistokemi, är fördelningarna av Dlg och Hts observerats att överlappa på det postsynaptiska membranet av larv NMJs, men är de i ett komplex i denna region ^8? Som nyligen visat och beskrivs ytterligare här, är Proximity Ligation Assay (PLA) används för att leta efter en in situ samband mellan Dlg och Hts specifikt på larver NMJ ^27.

PLA är en relativt ny teknik som används mestadels i cell- och vävnadskultur som kan detektera protein-proteininteraktioner in situ ^9. I denna analys är primära antikroppar mot de två proteiner av intresse detekteras med ett par av artspecifika sekundära antikroppar, benämnda PLA prober, vilka är konjugerade till oligonukleotider (Figur 1A, B). Om två-proteinets är i nära anslutning till varandra (dvs inom några tiotal nanometer), avståndet mellan de bifogade PLA sonder kan överbryggas genom hybridisering av ytterligare två oligonukleotider anslutnings (Figur 1C). I denna konformation, de fria ändarna av oligonukleotider kontaktdons är tillräckligt nära för att få kontakt med varandra, och en sluten cirkulär DNA-molekyl kan bildas vid in situ ligering (figur 1D). Den cirkulära DNA-molekylen tjänar som en mall för in situ rullande cirkel-amplifiering, som laddas genom att en av de oligonukleotider som är konjugerade till PLA prober (figur 1E). Sekvenser inom den erhållna amplifierade, concatemeric DNA-produkt kan sedan visualiseras med fluorescensmärkta, komplementära oligonukleotidsonder (figur 1F). Eftersom det förstärkta DNA förblir fäst till ett av PLA sonder, subcellulära lokalisering av protein-proteininteraktion withina vävnad kan lätt fastställas.

Flera metoder används allmänt för att detektera protein-proteininteraktioner, inklusive in vitro-tekniker såsom sam-immunutfällning, pull-down-analyser och jäst två-hybridscreening, och in vivo-tekniker såsom Förster resonansenergiöverföring (FRET) och Bimolecular Fluorescens Komplettering ( BiFC). En fallgrop av de tekniker in vitro är att de inte identifiera var interaktionen endogent förekommande, medan den tidigare nämnda in vivo tekniker innebär den konstgjorda uttryck av fusionsproteiner som inte kan återspegla det nativa beteendet hos sina endogena motsvarigheter. En stor fördel med PLA är att det är i stånd att bestämma i en vävnad subcellulära lokalisering av endogena protein Interactmedlemmar som är i omedelbar närhet till varandra och sannolikt bildar ett komplex, med graden av närhet krävs för att generera en signal som är jämförbar till FRET och BiFC. PLA kan detektera interaktioner med hög specificitet och känslighet på grund av koppling av antikropps-igenkänning och DNA-amplifiering. Således kan analysen generera diskreta, ljusa signaler i form av puncta som avslöjar den exakta positionen för interaktionen. Dessutom kan knappast synliga antigener detekteras. Slutligen är PLA en relativt enkel teknik för att utföra, och det tar längre tid än en vanlig immunhistokemisk förfarande för att slutföra. Därför ger PLA en teknisk fördel jämfört med andra protein-proteininteraktioner analyser som ofta plågas med långa förberedelsetider och omfattande felsökning.

Detta protokoll visar hur PLA kan appliceras på Drosophila larv NMJ i syfte att detektera endogena protein-proteininteraktioner in situ. Här är PLA utförs på larvkroppen vägg muskelpreparat där Dlg och Hts visar sig faktiskt existera i en komplex på den postsynaptiska regionen av NMJs. PLA har inte tidigare använts för att studera larver NMJ, och det finns i dagsläget bara en handfull publicerade artiklar som har använt denna analys i Drosophila vävnad. Förhoppningen är att ytterligare exponering av PLA till Drosophila samfundet kommer att leda till att en ökad användning som ett kompletterande verktyg för att komplettera andra, mer allmänt använda protein-proteininteraktioner analyser.

Protocol

1. Body Wall Förberedelse OBS: Beredning av tredje stadiet larver kroppsväggar (för studier av de NMJs som innerverar kroppen väggen muskler) utfördes som tidigare beskrivits i Brent et al 10, eller Ramachandran och Budnik 11,12, men med vissa modifieringar.. Dissektion Höj gylflager och korsningar vid 25 ° C under 5-6 dagar under användning av standardförfaranden 13. Plocka krypa tredje stadiet larver …

Representative Results

I vildtyp tredje stadiet larver NMJs är Dlg övervägande finns på postsynaptiska membran av typ I glutamaterga boutons, med Dlg Immunoreaktivitet nivåer är mer uttalad i typ IB boutons än typ Är boutons (Figur 3A) 4. Hts är närvarande under hela muskeln utan koncentrerar vid postsynaptiska regionen med Hts immunreaktivitet nivåer som förekommer lika i både typ I boutons, och finns även presynaptiskt (Figur 3A ') 8,17. Observera att fördelning av D…

Discussion

Denna rapport visar hur PLA kan tillämpas på Drosophila larv NMJ. Analysen utförs på larvkroppen vägg muskelpreparat i syfte att upptäcka endogena protein-proteininteraktioner närvarande vid NMJ. Med denna teknik är Dlg och Hts visat sig vara i nära anslutning till varandra, och därmed existera i en komplex, speciellt på den postsynaptiska regionen ^27. Till stöd för detta resultat, har en tidigare studie bevisat att de tillsammans med följande uppgifter: 1) de immunreaktiva distribution…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040