Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo di Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
وقد مكن تطوير تقنيات استهداف الجين بناء خطوط الخلايا ونماذج الماوس للتحقيق في الأنظمة البيولوجية المختلفة 1-3. والمرحلة الأولى الأساسية في تعديل تسلسل الجيني هو تصميم وبناء الجينات التي تستهدف ناقلات 4. النواقل التي تستهدف هي يبني البلازميد التي تحمل أليل من الفائدة التي تحتوي على التعديلات المرغوبة (ق) يحيط بها علامة الاختيار (على سبيل المثال، النيومايسين)، والمناطق الجينومية الطويلة اللازمة لكفاءة إعادة التركيب مثلي في خلايا الثدييات 5. ويتحقق الدقيق تعديل الجينات من خلال إدخال متجه إلى استهداف الجذعية الجنينية (ES) خلايا 6 أو 7 الخلايا الجسدية، حيث إعادة التركيب مثلي بين مساحات مماثلة من تسلسل الحمض النووي على ناقلات الاستهداف والنتائج موضع الجينومية في نقل تعديل المقصود إلى الجينوم عن طريق تحويل الجينات 8. هذا modifiخلايا ES إد يمكن حقنها في الكيسات الأريمية الماوس لإنتاج نسل (chimaeras) التي يمكن بعد ذلك نقل هذه الأليلات المعدلة عبر الجرثومية 9. طرق بديلة لإنتاج الفئران المعدلة وراثيا ينطوي على Microinjection من متجه التعبير الجيني في واحدة بيضات ملقحة الماوس الخلية، مما يؤدي إلى التكامل عشوائية من متجه في جينوم الفأر 10. وقد اعتمدت الطرق التقليدية في البناء على ناقلات التقليدية "قص ولصق" الاستنساخ باستخدام أنزيمات التقييد وligases DNA لاستنساخ علامة الاختيار مختلفة وشظايا الجينومية في العمود الفقري النواقل. ومع ذلك، عاملا يحد المتأصل في الاستنساخ التقليدي هو تحديد المواقع واختيار مواقع التقييد، وخاصة مع تسلسل الحمض النووي أطول. وغالبا ما يتطلب خطوات استنساخ فرعي متعددة وأيضا يدخل تسلسل الحمض النووي غريبة في ناقلات، الذي غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة من استهداف الجينات.
Recombineering (ENG recombinogenicineering) هو تقنية الهندسة DNA أن يتغلب على هذه القيود باستخدام إعادة التركيب مثلي (HR) بوساطة البروتينات فج إعادة التركيب في E. خلايا القولونية 11،12. منذ أن أي منطقة من تسلسل مثلي بمثابة ركيزة من recombineering، تتم إزالة القيود من توافر مواقع قيود. تسلسل الحمض النووي كبيرة يمكن تعديلها بسهولة مباشرة في الجسم الحي، وبالتالي الحفاظ على السلامة الهيكلية أيضا على 13. Recombineering فعال جدا مع homologies قصيرة (50 نقطة) ويمكن إدراج 14 وبالتالي الأسلحة التماثل (HA) مريح في تسلسل بنسبة ضئيلة الاصطناعية. في تجربة نموذجية recombineering، وبنسبة ضئيلة أو مزدوج DNA الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) جزء يحتوي على HA هو electroporated إلى recombineering المختصة E. خلايا القولونية التي تحتوي على الهدف تقع إما على كروموسوم أو على البلازميد 15. تمنح إمكانيات إعادة التركيب من قبل التعبير محرض للتفصيل الأحمرombination البروتينات من فج 16،17 أو البروتينات RecET من طليعة العاثية RAC 18. ونوكلياز خارجية الأحمر / RECE تحويل dsDNA الخطية إلى DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) وسيطة، والتي يتم بعد ذلك ملزمة شريكتها الأحمر / مصحح، وهو بروتين الصلب واحد الذين تقطعت بهم السبل (SSAP) 19. والصلب من ssDNA طويلة أو قصيرة بنسبة ضئيلة لسلسلتها الهدف مكملة يحدث على حبلا متخلفة من شوكة تكرار ويؤدي إلى إدراج تسلسل في الموقع المستهدف. متخلفة حبلا ssDNA إعادة التركيب هو أساس كفاءة عالية من recombineering ويمكن وصفها من قبل 'بيتا' نموذج إعادة التركيب 20،21.
وسير العمل recombineering نموذجي لبناء ناقلات استهداف الجين ينطوي على أي من طريقين التالية. واحد الطريق ينطوي على استنساخ فرعي المنطقة الجينومية المرجوة من استنساخ فأر BAC إلى البلازميد يليه الإدراج متتابعة من المواقع إعادة التركيب LoxP، علامة الاختيار <sتصل> 22 الخ، أو الطريق البديل ينطوي على استهداف BAC موضع الجيني مع مختلف عناصر مكافحة ناقلات استهداف من قبل جولات متعددة من recombineering 10،23 ثم استنساخ فرعي موضع المعدلة في البلازميد بواسطة إصلاح الفجوة استنساخ 24،25. وقد استخدمت الاختلافات حول هذا الموضوع في مختلف خطوط أنابيب عالية الإنتاجية recombineering كجزء من برامج إنتاج الماوس كبير 26،27. ومع ذلك، تنطوي هذه الإجراءات مراحل معقدة وطويلة، تتطلب استخدام ناقلات المتخصصة وE. القولونية سلالات (على سبيل المثال، لجنة المساواة العرقية معربا عن الخلايا) والاستفادة من واحد أو أكثر من الخطوات الوسيطة من متجه تنقية الحمض النووي وإعادة التحول (الجدول 1). استنساخ فرعي الإدراج زائد (SPI) هو أسلوب recombineering الرواية التي تجمع بين إعادة التركيب بيتا وإصلاح الفجوة الاستنساخ في عملية واحدة (الشكل 1). SPI التجمع ناقلات بسيط، سريع ومرن ويوفر تحسنا كبيرا على recombi القياسيةنهج neering (الجدول 1). هنا، علينا أن نظهر سهولة وجدوى استخدام SPI لمختلف التطبيقات بناء ناقلات مع التركيز بشكل خاص على بناء تصاميم غير القياسية وتحدي النواقل. وتشمل حالات الاختبار بناء الفلورسنت مراسل knockin ناقلات، مزدوج الموسومة التعبير البروتين ناقلات knockin، وهو BAC الفلورسنت مراسل النواقل وبالضربة القاضية ناقلات مشروط. هذه دراسة بأشكال مختلفة شرط لحصر مستقبلات سطح الخلية، تنقية مجمع البروتين النووي أو يجتذ مشروط التعبير عن الجين.
بناء خطوط الخلايا ES ونماذج الماوس وشمل تاريخيا استهداف الجينات باستخدام يبني البلازميد التي تحتوي على أليل تعديل 4. ومع ذلك، فقد ثبت أن بناء هذه النواقل التي تستهدف الجينات المعقدة ليكون عنق الزجاجة كبير في إنتاج مثل هذه النماذج في الوقت المناسب. وقد سمح وضع استراتيجيات بناء ناقلات recombineering أساس تصاميم ناقلات تحسين والتجمع ناقلات أكثر كفاءة. ومع ذلك، بروتوكولات recombineering الحالية لا تزال تنطوي على خطوات متعددة، تتطلب تنقية البلازميد المتوسطة واستخدام سلالات بكتيرية مختلفة. استنساخ فرعي الإدراج زائد يقدم نهجا جديدا لبناء ناقلات التي يمكن القيام بها في حالة Electroporation للواحد في سلالة المضيف BAC المقيمين. تم اختبار فائدة SPI في استهداف الجين هنا في مجموعة متنوعة من التطبيقات بناء ناقلات الأمراض. في جميع الحالات درست هنا، وثبت SPI لتكون فعالة وتم إنتاج البلازميد المؤتلف الصحيح.في الغالبية العظمى من الحالات، تم إدراج أشرطة مختلفة متعددة بشكل صحيح في ناقلات الاستهداف. أشرطة DNA الكبيرة وناقلات تم استيعابها بسهولة في بروتوكول SPI وأظهرت مرونة هذا النظام.
يعتمد SPI على استخدام تسلسل تناظر طويلة وphosphorothioate (PTO) حماية أشرطة DNA الخطية. تعديل PTO يمنح حماية ضد exonucleases على الحمض النووي الخطي 20،21 وHA طويلة يزيد من كفاءة إعادة التركيب للسماح المتنوعة. ومع ذلك، والتوليف من تسلسل بنسبة ضئيلة أطول يزيد من فرص تراكم الأخطاء خصوصا الحذف. الطفرات في جزئية يمكن أن يكون ضارا ولا سيما إذا كانوا تغطية المناطق البروتين الترميز. ينصح بشدة تسلسل الحمض النووي عبر HA وتغطية طول كامل من الكاسيت إدراجها للقضاء على الحيوانات المستنسخة مع أي تعديلات التسلسل. ويقترح استخدام نظام البلمرة DNA عالية الدقة أيضا لتجنب إدخالأخطاء ذ PCR. طول وتكوين HA من البلازميد استنساخ فرعي هو أكثر أهمية بالنسبة لتلك التي الكاسيت الإدراج (لا تظهر البيانات). وبالنسبة للتطبيقات ذات حساسية خاصة مثل بناء ناقلات knockin، حيث لا يتم التسامح مع أي طفرات في المناطق اكسون، وHA من الكاسيت الإدراج يمكن اختصارها (50-120 بي بي) لتفادي المشاكل المرتبطة oligos طويلة. ويمكن أيضا الكاسيت الإدراج أن تترك phosphorothioated معدلة أو المزدوجة (حيث معرفة اتجاه تكرار غير متوفرة). ولكن مضاعفة في هذه الحالات لا يزال يتطلب محمية لفترة طويلة HA البلازميدات استنساخ فرعي. والتحذير من هذه الاستراتيجية معينة هو خفض كفاءة المتنوعة التي يمكن أن تؤثر SPI الاستنساخ في مواضع مختلفة.
طول كاسيت الإدراج والبلازميد هو استنساخ فرعي معلمة هامة أخرى في SPI الاستنساخ. جزيئات DNA أكبر electroporate أقل كفاءة وتأثير تراكمي، نظرا لإعادةquirement لتقديم كافة الأشرطة في نفس الخلية (لا تظهر البيانات). مضاعفة هو الأكثر كفاءة مع أشرطة الإدراج أصغر. DNA شظايا أكبر من 3 كيلوبايت أيضا وضع حد على معالجة ssDNA الأحمر بوساطة، والتي هي الأكثر كفاءة تصل إلى 3 كيلو بايت 30. أشرطة الإدراج تتجاوز 3 كيلو بايت هي مزدوجة مقطوعة وتمتزج أقل بكفاءة عن طريق بيتا مسار مستقل 20. لذلك، وفحص المستعمرات كافية لتحديد استنساخ الصحيح يصبح من المهم في هذه الحالات. مدة أطول من إعادة التركيب آخر Electroporation لليزيد أيضا من فرص الشفاء من استنساخ الصحيح في التدريبات SPI الصعبة. ما يصل إلى أربعة أشرطة صغيرة (<1.5 كيلوبايت) يمكن إدراجها في وقت واحد مع عملية SPI، على الرغم من كفاءة مضاعفة تتناقص مع كل كاسيت إضافية (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، وهذا يعكس نتائج تجربة SPI الأمثل ويستحسن النظر في حدود المتنوعة عند استخدام العديد من أشرطة كبيرة. </P>
تطوير أدوات التحرير الجينوم مثل تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) نظام نوكلياز داخلية -cas9 وقد مكن إنشاء التعديلات الجينوم جديدة وأدى إلى زيادة كفاءة الهندسة الجينوم 36. ومع ذلك، فقد استكملت هذه التكنولوجيات الجديدة الجينات التي تستهدف ناقلات بدلا من حلت محل لهم. ومن المتوقع أن النظام كريسبر-CAS يمكن أن تحل محل اختيار المضادات الحيوية وزيادة صقل بروتوكول recombineering متعدد.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |