We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
Динамика отдельных молекул на живых клетках способствует их биологической функции. Одноместный флуоресцентной томографии молекула является популярным методом для изучения динамики одной молекулы на поверхности клеток 1,2,3. Тем не менее, наиболее часто используемые датчики изображений в этих исследованиях есть несколько важных недостатков. Например, обычные органические красители и флуоресцирующие белки обеспечить умеренную яркость, около 10 5 -10 6 М -1 см -1, но фотохимически нестабильны, отбеливание после испускания около 10 5 -10 6 фотонов в типичных условиях обработки изображений живых клеток 4,5. В отличие от этого, полупроводниковые наночастицы, часто называемые квантовые точки (КТ), значительно ярче и стабильнее, с коэффициентов поглощения в диапазоне 10 6 -10 7 М -1 см -1 и более 10 7 -10 8 испускаемые фотоны перед photobleaching 5. Улучшенная яркость и фотостабильность КТ более органических флуорофоров позволяет наблюдение одиночных молекул в значительно более быструю смену кадров и более гораздо дольше траекторий 6.
Несмотря на их преимущества и коммерческой доступности, несколько обязательства остаются для этих мощных визуализирующих агентов. Во-первых, они плохо определены таргетинга валентность, которая может привести к сшиванию целевых биомолекул 6. Во-вторых, они обычно имеют большой гидродинамический размер (> 20 нм), что ограничивает доступ к некоторым переполненных сотовых средах 7. В-третьих, они имеют ограниченную ориентации модульность 7. Несколько стратегий пытались решить эти проблемы 8,9,10, но обычно требуют специальных знаний и реагенты для реализации.
Для решения этих проблем, мы недавно сообщили стратегию "Стерическое исключения" для подготовки моновалентная, небольшой, имодульные КТ 11. КТ обернуты одной долго фосфоротиоат ДНК (птДНК) полимера. ПтДНК связывается с поверхностью КТ через несколько взаимодействий Zn-S между поверхностными, подвергшихся воздействию атомов Zn и фосфоротиоатных групп птДНК полимера. Одним прыжком полимер пространственно и электростатическим исключает связывание дополнительных эквивалентов полимера без существенного увеличения общего размера частицы (около 2 нм). Все реагенты коммерчески доступны, продукты образуются с высоким выходом, и этот процесс требует только шаги обессоливания для очистки. После помечены, КТ, обернутые с одной птДНК (mQDs) связываться с комплементарными нитями ДНК, несущих таргетинга доменов (например, бензилгуанин (BG), benzylcytosine или алкилгалогениды).
Эти функциональные нацелены на mQDs специально для ферментативных меток, таких как SNAP, CLIP & HALO, генетически, слитых с интересующего белка. Это протокол для синтеза, Таргетинг, и живых клеток томография mQDs производимых стерической исключения.
Модульность конструкции MQD позволяет повышенную степень экспериментальной гибкости. Например, различные mQDs могут быть быстро подготовлены в уникальных цветов, позволяющих для одновременного визуализации нескольких целей. Направленный последовательность онДНК может направить mQDs с белками, сахара 12, липиды и поверхностей 13. Ряд ферментативных меток доступны с ортогональным реакционной, позволяя несколько целей для включения в образ одновременно с дифференциально целевых mQDs. В дополнение к ориентации с SNAP тега, маркировка белков-мишеней с mQDs с помощью зажима тег, гало тег, и биотинилированными белков также был успешным. Этот протокол демонстрирует специфическую маркировку поверхности рецептора на живых клеток с этими mQDs, но протокол может быть легко адаптирован к ряду различных контекстах.
Значительные методологические понимание в производстве mQDs с определенной валентности, что ~ 50 фосфоротиоат-связаныосновы обязаны обернуть КТ (и тем самым предотвратить две молекулы от привязки одновременно). Поли-S 50 последовательность воспроизводимо и устойчиво связанной 605 нм КТ от Life Technologies. Хотя этот продукт был прекращен, стерический стратегия исключение распространены на аналогичные продукты других производителей, имеющих разные размеры, формы, спектральные свойства.
Эффективность и стабильность птДНК завернутых КТ критически зависит от химии поверхности и структуры квантовых точек. Поэтому успех протокола будет зависеть от коммерческого источника и химической структуры квантовых точек. Для целей данного протокола, три основных точки разницы существуют между различными коммерческих источников КТ: разница в условиях, необходимых для передачи фазы; Разница в силе первоначального ПЭГ-тиол-лигандсвязывающим, возможно, препятствующей перемещению по птДНК; и разница в размере открытой ядра CdSe, которые могут леобъявление к тушению КТ по условиям передачи тиол фазовых MPEG.
По состоянию на публикации, КТ с лучшим структуры для производства mQDs являются 4-10 нм CdSe / основные ZnS / оболочка КТ, приобретенные у компании Life Technologies с спектров излучения в 545, 585, 605 и 625 нм (рисунок 2А). КТ, основанные на 'Vivid' формулировки (545, 605 и т.д.) утолить при добавлении мПЭГ тиол и не предназначены для такого применения. КТ от Aldrich и океана Нанотех хорошо работать, но требуют шаги передачи больше фазовые и предварительную обработку оксида триоктилфосфин. Этот протокол был оптимизирован для КТ с Life Technologies.
Последовательность поли-фосфоротиоат используется, чтобы обернуть КТ прекращается с родным 20-мерной хвоста ДНК, содержащего последовательность (ACTG) 5, в которой таргетинг прядь может гибридизации. Эта последовательность удобно, так как он имеет практически нет вторичной структуры, и останется hybridizред при 37 ° С в PBS. Если есть доступ к ДНК-синтезаторе, птДНК может быть синтезированы, а затем очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки С 8. ПтДНК будет элюировать позже на ВЭЖХ, чем эквивалентные олигонуклеотидов с носителем позвоночника. Мы, как правило, покидают 5 'DMT защитную группу на наших фосфоротиоатных олигонуклеотидов после очистки.
Пассивация птДНК завернутых КТ обычно требуется для того, чтобы улучшить коллоидной стабильности КТ и снижения фон обязательными для самых экспериментальных приложений. Протокол использует PEG-слой пассивации КТ. Карбокси ПЭГ алканов тиол с дополнительным PEG единиц ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, карбокси-PEG12 алканов тиол) обеспечивает значительно снижается фон, хотя более длинные колышки как больше, так, и в целом более дорогим. mQDs покрытые карбокси ПЭГ алкапе тиоловых лиганды обладают высокой стабильностью в физиологических буферах, таких как фосфатный буферный солончаков и питательных сред. Длительное хранение (> 8 месяцев) из mQDs при 4 ° С не показали значительного агрегации или птДНК отряд 11. В зависимости от эксперимента, ПЭГ пассивация КТ сам по себе не всегда в достаточной степени снизить неспецифического связывания из mQDs. Инкубация как клетки и mQDs в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), содержащем 3% БСА в течение 20 мин перед существенно снижает использование неспецифического связывания с клетками, хотя это увеличивает видимую гидродинамический радиус mQDs на ~ 50%. Пассивации с 0,5% казеина уменьшает неспецифическое связывание еще больше, но это увеличивает видимый размер в большей степени, чем BSA.
5'-конец из нити ДНК, комплементарной к mQDs может быть изменен, чтобы позволить ориентации ряда различных биомолекул. Есть несколько установленных методов доступны ковалентно модифицировать белки, Lipids & сахара с одноцепочечной ДНК (оцДНК). До тех пор пока оцДНК представлена внеклеточно, она доступна для растворимых mQDs. mQDs с вышеупомянутых последовательностей будет быстро гибридизации с их комплементарной цепи ДНК в условиях культивирования клеток. 10-20x поли (КТ) спейсер между птДНК и таргетинга последовательности могут потребоваться для эффективной ориентации таким образом, чтобы повысить фиксирующей последовательности над толщиной и отрицательно заряженных гликокаликса клетки. Для этого протокола мы выбрали для получения BG-ДНК с комплементарной последовательностью (CAGT) 5, что будет как гибриды с mQDs и ковалентно связать себя с белком SNAP-тега для быстрого и конкретного маркировки. Аналогичная функции протокола также для соединения с другими NHS-эфиры в аминокислотных-модифицированных олигонуклеотидов.
Для визуализации одиночных молекул, низкой плотности маркировки, как правило, необходимо, чтобы решить отдельные молекулы. Конечная концентрация MQD из ~ 0,5 нМ в PBS с пассиватораявляется хорошей мишенью. Тем не менее, эти высокие разведения иногда приводило к недостаточно маркировки клеток. Если это происходит, дополнительное MQD могут быть добавлены, пока не наблюдается оптимальная плотность маркировки. В случае SNAP-меченого человеческого Notch1, концентрации> 10 нМ MQD получают плотные маркировки клеток в то время как 0,5 нМ MQD в результате присоединения ~ 20 mQDs на базальной поверхности клетки-мишени (смотри фиг.4В). Сотовый маркировка с mQDs в высокой степени зависит от слияния из посеянных клеток. Чрезмерно сливающиеся клетки не маркировать на их базальных поверхностей.
Таким образом, простой способ для генерации моновалентную и модульные КТ было описано. Эти mQDs найти применение в широком диапазоне живых приложений обработки изображений клеток, о чем свидетельствует визуализации Notch рецептор на живых клетках U2OS. Применимость mQDs не ограничивается этом конкретном случае, но может быть продлен на потенциально других клеточных мишеней, таких как другие белки, нуклеиновые кислоты и ферментов.
The authors have nothing to disclose.
Финансирование обеспечивается DOD W81XWH-10-1-1023 (ZJG), грант P50 GM081879 от UCSF Центра систем и синтетической биологии (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) и NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS поддержали человека Frontier Science Program междисциплинарных постдок исследовательской общении.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |