We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
La dinámica de las moléculas individuales en células vivas contribuye a su función biológica. Formación de imágenes de fluorescencia sola molécula es un método popular para estudiar la dinámica de moléculas individuales en la superficie de la célula 1,2,3. Sin embargo, las sondas de imagen más comúnmente utilizados en estos estudios tienen varias desventajas importantes. Por ejemplo, los tintes orgánicos convencionales y proteínas fluorescentes proporcionan brillo moderado, aproximadamente 10 5 -10 6 M -1 cm -1, pero son fotoquímicamente inestable, blanqueo después de la emisión de aproximadamente 10 5 -10 6 fotones en condiciones típicas de formación de imágenes de células vivas 4,5. Por el contrario, las nanopartículas semiconductoras, llamados con frecuencia puntos cuánticos (QDs), son significativamente más brillante y más estable, con coeficientes de extinción en el rango de 10 6 -10 7 M -1 cm -1 y superior a 10 7 -10 8 fotones emitidos antes photobleaching 5. El brillo mejorado y fotoestabilidad de los puntos cuánticos más fluoróforos orgánicos permite la observación de moléculas individuales a velocidades de cuadro significativamente mayores y más mucho más tiempo trayectorias 6.
A pesar de sus ventajas y disponibilidad comercial, varios pasivos se mantienen para estos poderosos agentes de imagen. Primero, han valencia de focalización, que puede resultar en la reticulación de biomoléculas específicas 6 mal definida. En segundo lugar, por lo general tienen un gran tamaño hidrodinámico (> 20 nm) que limita la accesibilidad a ciertos ambientes celulares de hacinamiento 7. En tercer lugar, han limitado la orientación modularidad 7. Varias estrategias han tratado de abordar estos problemas 8,9,10, pero generalmente requieren unos conocimientos y reactivos especializados de implementar.
Para hacer frente a estos problemas, nos informó recientemente una estrategia de "exclusión estérica" para preparar monovalente, pequeñas ymodulares puntos cuánticos 11. Los puntos cuánticos se envuelven con un solo polímero de ADN fosforotioato largo (ptDNA). El ptDNA une a la superficie QD a través de múltiples interacciones Zn-S entre la superficie expuesta átomos de Zn y de los grupos fosforotioato del polímero ptDNA. Un único polímero unido electrostáticamente y excluye estéricamente la unión de equivalentes adicionales del polímero sin aumentar significativamente el tamaño global de la partícula (aproximadamente 2 nm). Todos los reactivos están disponibles comercialmente, se forman productos con un alto rendimiento, y el proceso requiere pocos pasos de desalinización para la purificación. Una vez marcado, puntos cuánticos envueltos con una sola ptDNA (MQDS) se unen a las hebras de ADN complementarias que llevan dominios dirigidos (por ejemplo, bencilguanina (BG), benzylcytosine, o haluros de alquilo).
Estas funcionalidades se dirigen a los MQDS específicamente para etiquetas enzimáticas tales como SNAP, CLIP Y HALO que se fusionan genéticamente para la proteína de interés. Se trata de un protocolo para la síntesis, Focalización y imágenes de células vivas de MQDS producidas por la exclusión estérica.
La modularidad del diseño MQD permite un mayor grado de flexibilidad experimental. Por ejemplo, una variedad de MQDS se puede preparar rápidamente en colores únicos que permiten la formación de imágenes simultánea de múltiples objetivos. La secuencia dirigida ssDNA puede dirigir MQDS a las proteínas, azúcares, lípidos 12 y las superficies 13. Una serie de etiquetas enzimáticas están disponibles con reactividades ortogonales, lo que permite múltiples objetivos para obtener imágenes de forma simultánea con MQDS diferencialmente dirigidas. Además de la orientación con la etiqueta SNAP, el etiquetado de proteínas diana con MQDS usando la etiqueta CLIP, la etiqueta HALO, y proteínas con biotina también tuvo éxito. Este protocolo demuestra el etiquetado específico de un receptor de superficie en células vivas con estos MQDS, pero el protocolo podría ser fácilmente adaptado a una serie de contextos diferentes.
La idea metodológica significativa en la producción de MQDS con valencia definido es que ~ vinculado-fosforotioato 50se requieren bases para envolver los puntos cuánticos (y por lo tanto evitar que dos moléculas de unión de forma simultánea). A-Un poli secuencia S 50 reproducible y estable vinculado 605 puntos cuánticos nm de Life Technologies. Aunque este producto ha sido descontinuado, la estrategia de exclusión estérica es generalizable a los productos similares de otros fabricantes que tengan diferentes tamaños, formas, propiedades espectrales.
La eficiencia y la estabilidad de los puntos cuánticos envueltos-ptDNA depende críticamente de la química de la superficie y la estructura de los puntos cuánticos. Por lo tanto, el éxito de un protocolo dependerá de la estructura química y fuente comercial de los puntos cuánticos. A los fines de este protocolo, existen tres principales puntos de diferencia entre varias fuentes comerciales de los puntos cuánticos: a diferencia de las condiciones necesarias para la transferencia de fase; una diferencia en la fuerza de, posiblemente obstaculizar el desplazamiento PEG-tiol-ligando de unión inicial por el ptDNA; y la diferencia en la cantidad de núcleo CdSe expuesta, que puede leanuncio a la extinción de la QD por las condiciones de transferencia de fase tiol MPEG.
A partir de la publicación, los puntos cuánticos con la mejor estructura para la producción de MQDS son los puntos cuánticos 4-10 nm CdSe / ZnS núcleo / corteza adquiridos de Life Technologies con espectros de emisión a 545, 585, 605 y 625 nm (Figura 2A). Puntos cuánticos basados en la formulación 'Vivid' (545, 605, etc) apagan tras la adición de mPEG tiol y no son adecuados para esta aplicación. Puntos cuánticos de Aldrich y Océano Nanotech funcionan bien, pero requieren pasos de transferencia de fase más larga y el tratamiento previo con óxido trioctilfosfina. Este protocolo ha sido optimizado para los puntos cuánticos de Life Technologies.
La secuencia poli-A fosforotioato utilizado para envolver los puntos cuánticos se termina con una cola de ADN 20-mer nativo que contiene la secuencia de (ACTG) 5 al que una hebra diana puede hibridar. Esta secuencia es conveniente, ya que tiene poca o ninguna estructura secundaria, y seguirá siendo hybridized a 37 ° C en PBS. Si se tiene acceso a un sintetizador de ADN, la ptDNA por se sintetiza y después se purificó por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC) usando una columna C 8. El ptDNA se eluye más tarde en la HPLC de oligonucleótidos equivalentes con una columna vertebral nativa. Normalmente nos dejamos 5 'DMT grupo protector en nuestros oligonucleótidos fosforotioato después de la purificación.
La pasivación de los puntos cuánticos envueltos-ptDNA por lo general se requiere con el fin de mejorar la estabilidad coloidal de los puntos cuánticos y reducir la unión de fondo para las aplicaciones más experimentales. El protocolo utiliza un PEG-capa para pasivar los puntos cuánticos. Carboxi PEG alcano tiol con unidades de PEG adicional ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) C 11 H 12 23 SH, carboxi-PEG12 alcano tiol) proporciona redujo significativamente fondo, aunque los PEG más largas son tanto más grande, y generalmente más caros. MQDS recubiertas con PEG carboxi Alkaligandos tiol ne son muy estables en tampones fisiológicos tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato y medios de cultivo. El almacenamiento a largo plazo (> 8 meses) de MQDS a 4 ° C no mostró agregación significativa o ptDNA desprendimiento 11. Dependiendo del experimento, PEG pasivación de los puntos cuánticos por sí sola no siempre suficientemente reducir la unión no específica de los MQDS. La incubación de ambas células y MQDS en tampón fosfato salino (PBS) que contenía 3% de BSA durante 20 min antes de su uso reduce sustancialmente la unión no específica a las células, aunque sí aumenta el radio hidrodinámico aparente de los MQDS por ~ 50%. La pasivación con 0,5% de caseína reduce la unión no específica aún más pero aumenta el tamaño aparente a un mayor grado que BSA.
El extremo 5 'de una hebra de ADN complementaria a las MQDS puede ser modificado para permitir la orientación de un número de diferentes biomoléculas. Hay una serie de técnicas establecidos disponibles para modificar covalentemente las proteínas, lipids y azúcares con ADN de cadena sencilla (ssDNA). En tanto que el ssDNA se presenta extracelularmente, es accesible a MQDS solubles. MQDS con las secuencias anteriores se hibridarán rápidamente con su cadena de ADN complementaria en condiciones de cultivo celular. Un 10-20x poli (CT) espaciador entre el ptDNA y la secuencia diana puede ser necesaria para una eficiente orientación a fin de elevar la secuencia de unión por encima de la glycocalyx de espesor y con carga negativa de la célula. Para este protocolo elegimos para producir un ADN-BG con una secuencia complementaria de (CAGT) 5 que a la vez hibridado a los MQDS y ligarse covalentemente a una proteína en sí SNAP-tag para el etiquetado rápida y específica. A las funciones de protocolo similares bien para acoplar otros ésteres de NHS a oligonucleótidos modificados con amino.
Para imágenes de una sola molécula, una baja densidad de etiquetado se requiere típicamente para resolver moléculas individuales. Una concentración final del MQD ~ 0,5 nM en PBS con el agente de pasivaciónes un buen objetivo. Sin embargo, estas altas diluciones veces resultaron en menos de etiquetado de las células. Si esto ocurre, MQD adicional se puede añadir hasta que se observa una densidad óptima de etiquetado. En el caso de etiquetado-SNAP Notch1 humano, las concentraciones de> 10 nM MQD producen células de etiquetado densos, mientras que 0,5 nM MQD resultó en la unión de ~ 20 MQDS en la superficie basal de la célula diana (ver Figura 4B). Etiquetado celular con MQDS fue altamente dependiente de la confluencia de las células sembradas. Demasiado células confluentes no etiquetan en sus superficies basales.
En resumen, un método simple para generar monovalente y puntos cuánticos modulares se describió. Estos MQDS encuentran utilidad en una amplia gama de aplicaciones de imágenes de células vivas, como se demuestra por formación de imágenes del receptor Notch en células U2OS en vivo. Aplicabilidad de MQDS no se limita a este caso específico, pero puede ser potencialmente extenderse por otras dianas celulares tales como otras proteínas, ácidos nucleicos y enzimas.
The authors have nothing to disclose.
Financiamiento proporcionado por el Departamento de Defensa W81XWH-10/01/1023 (ZJG), P50 GM081879 subvención del Centro de UCSF para Sistemas y Biología Sintética (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) y NIH 1R21EB018044 (ZJG y YJ). DS fue apoyado por Human Frontier Ciencia Programa cruzada postdoc disciplinaria beca de investigación.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |