We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
A dinâmica de moléculas individuais em células vivas contribui para a sua função biológica. Imaging molécula de fluorescência único é um método popular para estudar a dinâmica única molécula na superfície das células 1,2,3. No entanto, as sondas de imagem mais comumente usados nestes estudos têm várias desvantagens importantes. Por exemplo, corantes orgânicos convencionais e as proteínas fluorescentes proporcionam brilho moderado, cerca de 10 5 a 10 6 M -1 cm -1, mas são fotoquimicamente instável, de branqueamento após a emissão de cerca de 10 5 -10 6 fotões sob condições típicas de processamento de imagens de células vivas 4,5. Em contraste, as nanopartículas de semicondutores, freqüentemente chamados de quantum dots (QDs), são significativamente mais brilhante e mais estável, com coeficientes de extinção na faixa de 10 6 -10 7 M -1 cm -1 e superior a 10 7 a 10 8 fótons emitidos antes photobleaching 5. O melhor luminosidade e fotoestabilidade de QDs mais de fluoróforos orgânicos permite a observação de moléculas individuais em taxas de quadro significativamente mais rápidas e mais muito mais tempo trajetórias 6.
Apesar de suas vantagens e disponibilidade comercial, vários passivos permanecer para esses agentes de imagem poderosos. Em primeiro lugar, eles têm pouco definida valência de segmentação, o que pode resultar na ligação cruzada de biomoléculas-alvo 6. Em segundo lugar, eles geralmente têm um tamanho grande hidrodinâmico (> 20 nm) que limita a acessibilidade a determinados ambientes celulares lotados 7. Terceiro, eles têm limitado visando modularidade 7. Várias estratégias têm tentado resolver estes problemas 8,9,10, mas geralmente exigem conhecimento e reagentes especializada para implementar.
Para resolver estes problemas, informou recentemente uma estratégia "de exclusão espacial" para a preparação monovalente, pequenas emodulares QDs 11. Os QDs são envolvidos com um único polímero de DNA fosforotioato longa (ptDNA). O ptDNA se liga à superfície através de interacções múltiplas QD Zn-S entre átomos de Zn expostos à superfície e os grupos fosforotioato do polímero ptDNA. Um único polímero estericamente ligada electrostaticamente e exclui a ligação de equivalentes adicionais do polímero sem aumentar significativamente o tamanho total da partícula (cerca de 2 nm). Todos os reagentes estão comercialmente disponíveis, os produtos são formados com um rendimento elevado, e o processo requer poucos passos de dessalinização para purificação. Uma vez marcado, QDs embrulhados com um único ptDNA (MQDS) se ligam a cadeias de DNA complementares que ostentem domínios de segmentação (por exemplo, benzilguanina (BG), benzilcitosina, ou halogenetos de alquilo).
Estas funcionalidades alvo as MQDS especificamente para etiquetas enzimáticas, tais como SNAP, CLIP & HALO que são geneticamente fundido com a proteína de interesse. Este é um protocolo para a síntese, Direcionamento e imagem ao vivo de células de MQDS produzidos por exclusão estérica.
A modularidade do design de MQD permite um maior grau de flexibilidade experimental. Por exemplo, uma variedade de MQDS podem ser rapidamente preparadas de cores únicas que permitem a gravação simultânea de múltiplos alvos. A seqüência de alvos ssDNA pode direcionar MQDS às proteínas, açúcares, lipídios e 12 superfícies 13. Um número de marcas enzimáticas estão disponíveis com reacções ortogonais, permitindo que múltiplos alvos a ser trabalhada em simultâneo com MQDS diferencialmente direcionados. Além de visar com a tag SNAP, rotulagem de proteínas-alvo com MQDS usando a tag CLIP, a tag HALO, e proteínas bioestanhados também foi bem sucedida. Este protocolo demonstra a marcação específica de um receptor de superfície de células vivas com estes MQDS, mas o protocolo pode ser facilmente adaptado a um certo número de diferentes contextos.
A visão metodológica significativa na produção MQDS com valência definido que é ~ 50-fosforotioato ligadoas bases são necessárias para envolver os QDs (e, assim, evitar que duas moléculas de ligação ao mesmo tempo). A poli-A seqüência S 50 reprodutível e estavelmente ligado 605 nm QDs da Life Technologies. Embora este produto foi descontinuado, a estratégia de exclusão espacial é generalizável a produtos similares de outros fornecedores com diferentes tamanhos, formas, propriedades espectrais.
A eficiência ea estabilidade dos QDs ptDNA-embrulhadas depende criticamente da química de superfície e estrutura dos QDs. Por conseguinte, o sucesso de um protocolo dependerá da estrutura química e fonte comercial de QDs. Para efeitos do presente protocolo, três grandes pontos de diferença existe entre as várias fontes comerciais de QDs: uma diferença de condições necessárias para a transferência de fase; uma diferença na força inicial de PEG-tiol-ligando de ligação, possivelmente impedir o deslocamento pelo ptDNA; e uma diferença na quantidade de núcleo exposto CdSe, que pode leanúncio para a extinção do QD pelo MPEG condições de transferência de fase tiol.
Como de publicação, QDs com a melhor estrutura para a produção de MQDS são 4-10 nm QDs CdSe / ZnS núcleo / invólucro adquiridos de Life Technologies, com espectros de emissão a 545, 585, 605 e 625 nm (Figura 2A). QDs baseados na formulação 'Viva "(545, 605, etc) extinguir por adição de mPEG tiol e não são adequados para esta aplicação. QDs de Aldrich e Oceano Nanotech funcionam bem, mas requerem etapas de transferência de mais de fase e pré-tratamento com óxido trioctilfosfina. Este protocolo foi otimizado para QDs de Life Technologies.
A sequência poli-A fosforotioato usado para embrulhar os QDs é encerrado com um rabo de DNA 20-mer nativa contendo a seqüência de (ACTG) 5 para que um fio de segmentação pode hibridizar. Esta sequência é conveniente, uma vez que tem pouca ou nenhuma estrutura secundária, e permanecerá hybridized, a 37 ° C em PBS. Se não há acesso a um sintetizador de DNA, o ptDNA pode ser sintetizado e, em seguida, purificado por meio de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (HPLC) utilizando uma coluna C 8. O ptDNA irá eluir mais tarde no HPLC de oligonucleótidos equivalentes com uma espinha dorsal nativa. Nós normalmente deixam o 5 'grupo protector DMT nos nossos oligonucleótidos fosforotioato após purificação.
Passivação das QDs ptDNA-embrulhados é geralmente necessária a fim de melhorar a estabilidade coloidal das QDs e reduzir a ligação de fundo para a maioria das aplicações experimentais. O protocolo utiliza um PEG-camada para passivar os QDs. Carboxi PEG tiol alcano com unidades de PEG adicional ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, carboxi-PEG12 alcano tiol) fornece significativamente reduzida fundo, embora os mais longos PEGs são tanto maiores, e geralmente mais caros. MQDS revestidos com PEG carboxi Alkaligandos tiol ne são altamente estáveis em tampões fisiológicos tais como fosfato tamponado salinas e meios de cultura. Armazenamento de longo prazo (> 8 meses) de MQDS a 4 ° C não mostrou agregação significativa ou ptDNA destacamento 11. Dependendo da experiência, a passivação de PEG QDs sozinho nem sempre suficientemente reduzir a ligação não específica das MQDS. A incubação de células e os dois MQDS em tampão fosfato salino (PBS) contendo 3% de BSA durante 20 min antes da utilização reduz substancialmente a ligação não específica de células, embora ele faz aumentar o raio hidrodinâmico aparente dos MQDS por ~ 50%. A passivação com 0,5% de caseína reduz a ligação não específica do mesmo, mas ainda aumenta o tamanho aparente de uma extensão maior do que o de BSA.
A extremidade 5 'de uma cadeia de ADN complementar às MQDS pode ser modificado para permitir a segmentação de uma série de diferentes biomoléculas. Há uma série de técnicas disponíveis estabelecidas para modificar covalentemente proteínas, lIPIDs e açúcares com ADN de cadeia simples (ssDNA). Enquanto o ADNcs é apresentada extracelularmente, é acessível a MQDS solúveis. MQDS com as sequências anteriores, irá hibridizar rapidamente com a sua cadeia de ADN complementar, em condições de cultura de células. Um 10-20x poli (CT) entre o espaçador ptDNA e a sequência de direccionamento pode ser necessária para a eficiente alvo, de modo a elevar a sequência de ligação acima do glicocálice espessura e de carga negativa da célula. Para este protocolo optou-se por produzir um DNA BG com uma sequência complementar de (CAGT) 5 que tanto hibridizada aos MQDS e covalente ligação-se a uma proteína SNAP-tag para marcação rápida e específica. Um protocolo semelhante também funções para acoplar outros ésteres NHS de oligonucleótidos modificados com amino.
Para uma única molécula de imagem, uma baixa densidade de rotulagem é normalmente necessária para resolver moléculas individuais. A concentração final da MQD ~ 0,5 nM em PBS com agente passivadoré um bom alvo. No entanto, essas diluições elevadas, por vezes, resultando em sub-marcação das células. Se isto ocorrer, MQD adicional pode ser adicionado até uma densidade óptima de rotulagem é observada. No caso de SNAP-etiquetado Notch1 humana, concentrações de> 10 nM MQD produzido células rotulagem densas enquanto 0,5 nM MQD resultou na ligação de ~ 20 MQDS na superfície basal da célula alvo (ver Figura 4B). Rotulagem celular com MQDS era altamente dependente da confluência das células plaqueadas. Excessivamente células confluentes não rotular, cujas superfícies basais.
Em resumo, um método simples para gerar monovalente e QDs modulares foi descrito. Estes MQDS encontrar utilidade na vasta gama de aplicações de imagem de células vivas, como demonstrado pela imagem do receptor Notch em células U2OS vivos. Aplicabilidade do MQDS não se limita a este caso particular, mas pode ser potencialmente prolongado por outros alvos celulares, tais como outras proteínas, ácidos nucleicos, e enzimas.
The authors have nothing to disclose.
Financiamento concedido pelo DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), concessão P50 GM081879 partir do Centro de UCSF de Sistemas e Biologia Sintética (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) e NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS foi apoiado pelo Programa Fronteira Humana cruzada pós-doutorado disciplinar bolsa de pesquisa.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |