リモート四肢虚血プレコンディショニング：げっ歯類における神経保護技術

Summary

リモート虚血プレコンディショニング（RIP）が損傷ストレスに対するコンディショニング組織の方法です。我々は、5〜10分間血圧計用カフを膨張させることによって、下肢のリモート虚血の方法を確立しました。 RIPの神経保護機能は、げっ歯類における網膜変性のモデルで実証されています。

Abstract

致死量以下の虚血は、患部組織における内因性のメカニズムのアップレギュレーションを介して以降の、より重度の虚血に対して組織を保護します。亜致死虚血は、遠隔組織における防御機構をアップレギュレートすることが示されています。哺乳動物の後肢虚血の短い期間（5〜10分間）は、脳、肺、心臓および網膜の自己防御応答を誘導します。効果は、リモート虚血プレコンディショニング（RIP）として知られています。それは重要な臓器を保護するための治療に有望な方法であり、心臓や脳の損傷のための臨床試験の下に既にあります。ラットの特に後肢 – – 虚血性このマニュアルでは、手足を作るの制御された、低侵襲性の方法を示しています。ヒト新生児に使用するために開発された血圧カフは、手動血圧計に接続され、後肢の上部の周りに160 mmHgの圧力を適用するために使用されます。皮膚温度を検出するように設計されたプローブはischemiを確認するために使用され皮膚脚動脈の圧力誘起閉塞によって引き起こされる温度、及びカフの解除後の温度上昇の低下を記録することによって、。 RIPのこの方法は、明るい光誘起損傷および変性に対するラットの網膜に保護を与えます。

Introduction

ほとんどの生存率は、おそらくすべて、代謝ストレスに直面した組織は、亜致死虚血^1,2の周期で前コンディショニングによって改善することができます。実用的な面で虚血プレコンディショニング（IP）は、その後の虚血性発作のような組織の経験より深刻なストレッサー、前に、亜致死虚血に対する組織の暴露です。動物モデルでは、IPは、脳、網膜、心臓や肺^3-6に印象的な保護を提供します。それに対応して、脳卒中患者における観察は、以前の一過性脳虚血発作、より良い臨床転帰^7,8との間のリンクを示しました。 IPは、非虚血性傷害⁹から網膜の光受容体を保護します。

多様な組織および傷害におけるIPの有効性は、それが全ての組織に存在する細胞生存の生来の機構を活性化していることを示唆しています。心筋の虚血プレコンディショニングはアップレギュレーションを介して保護効果を有することが示唆されていますアデノシンの放出を介して、またはミトコンドリアATPカリウムチャネル^10,11の開口部を介して多くの代謝経路を調節することが知られている低酸素誘導因子（HIF）、の。アデノシン放出およびATPカリウムチャネルは、脳虚血に関与しているですが、これまでの虚血性コンディショニングの神経保護機構の調査は、抗興奮毒性への変更、抗アポトーシスおよび抗炎症経路^12,13に焦点が当てられてきました。全体的に、神経細胞を保護するための虚血性コンディショニングの分子過程の理解は限られています。

リモート虚血プレコンディショニングの試みは、重要度の低い組織における虚血を生成することにより、離れた非常に重要な器官（心臓、脳、肺）を調整します。後肢を用いて遠隔虚血プレコンディショニング（RIP）は、脳卒中^14-17のげっ歯類モデルにおいて神経保護的であることが実証されています。我々が記載された方法は、簡単かつ信頼性のある非侵襲PROTを提供しますRIPを誘導するためのocol。

RIPプロトコルの大部分は、上部の後肢に位置大腿動脈の識別を容易にし、手術用クランプや止血帯のアプリケーションのためにアクセスすることができたためと思われる、後肢を伴います。脳と皮膚保護の研究のための侵襲性四肢虚血性の研究では、虚血は鼠径靭帯から大腿動脈を分離し、大腿動脈^2,15,18をクランプすることにより誘導されます。

四肢cuffingまたは大腿動脈クランプのいずれかに起因する虚血は、パルスの損失、酸素の減少と皮膚温度の低下などの四肢での変化により確認されています。リモート虚血は、レーザードップラーまたは超音波ドップラー^17-19を用いて、パルスの消失によって確認することができます。皮膚温度は関係が^20,21非線形であるが、ドップラーの代替として使用することができます。正確な温度記録は、研究所や缶では一般的です簡単にリモート虚血性の研究に組み込むこと。

手術をクランプ大腿する代わりに、止血帯を使用して、虚血の誘導です。止血帯アプリケーションは、血管クランプを用いて達成されるものに匹敵する虚血を作り出します。 Kutchner ら 。非侵襲的な止血にクランプ侵襲大腿動脈を比較し、両方の方法が四肢への血流を停止し、皮膚フラップ虚血¹⁸の形成外科モデルにおける皮膚損傷を減少が見出さ。脚または腕のいずれかをCuffingと収縮期血圧上にカフ圧を上昇させることは、ブタおよびヒト^17,19,22における虚血性損傷に対する保護であることが見出されています。

別の止血帯は、虚血性血圧カフ又は弾性バンド^17,22,23の使用を含む、リモート誘導に近づきます。しかし、虚血を誘導する弾性バンドを使用することは、潜在的に圧力の無秩序な量を生じさせる、危険な方法であります500 mmHgの上の圧力上昇と手足は、ヒト²⁴に記録されています。また、ゴムバンドを使用して、四肢虚血は、エバンスブルー色素、筋線維の透過性²⁵ の di vivoマーカーによって評価されるように、バンド²³の除去後のラットの筋肉の損傷につながります。対照的に、止血帯に制御された圧力の送達は、血圧計^17,19,22,26に接続された血圧カフを用いて達成することができます。

本研究では、光受容体変性の光損傷モデルは、リモート虚血プレコンディショニングの神経保護効果を実証しました。リモート虚血は、光損傷の直前に誘導し、網膜の機能試験によって確認されるように、その後の光受容体の変性を防止することができました。付属のビデオでは、非侵襲的なリモート虚血のアプリケーションのデモンストレーションを行います。

Protocol

倫理文は：プロトコルは、5657＃AECシドニー大学の動物ケアのガイドラインに従います。麻酔は、動物倫理委員会（シドニー大学、AEC＃5657）によって承認されました。 1.機器の準備リアルタイム皮膚温度トラッキングを使用してください。コンピュータ、およびデータ集録ハードウェアのスイッチをオンにします。 オープン温度記録ソフトウェアと30〜35の…

Representative Results

160 mmHgの上方に上昇した血圧カフは、 図1Bに明らかに見られるように、後肢への血流を停止します。組織酸素化の欠如は、虚血-再灌流プロトコル（ 図2）のために、動物の足の温度を低下させるが得られました。足の温度（33℃）は、コア温度よりも低くかつ確実にカフ圧の上昇（31°C）、カフが収縮したときに上昇（32℃）の間に減少しました。単一千ルクスの光損…

Discussion

げっ歯類の後肢虚血が正常網膜の光受容体に神経保護を提供する手動血圧計カフで誘導しました。光損傷^9,28からの光受容体の虚血性コンディショニング誘導される保護と一致して発見。

基本的に、リモート虚血は、組織への簡単な酸素欠乏を引き起こします。したがって、遠隔虚血プレコンディショニングは、虚血コンディショニングまたは代わりと呼ばれる?…

Materials

Gold series DuraShock Hand Aneroid Sphygmomanometer	Welch Allyn	DS56	Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 Tube, 10 Pack	Welch Allyn	5082-102-1	Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor	Welch Allyn	5082-178	Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod	AD Instruments	ML 309	skin tempertature unit
Skin temperture probe	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Skin temperature recorder
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Towel			optional: awake remote ischemia
Isoflo – 100% Isoflurane -250 ml	Abbot Animal Health	05260-05	optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil – ketamine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium – Xylazine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia