Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
Murinos y de esófago humano miofibroblastos se generan a través de la digestión enzimática. Neonato (8-12 días de edad) esófago murino se cosecha, picada, se lavó, y se sometió a digestión enzimática con colagenasa y dispasa durante 25 min. Muestras de resección esofágica Humanos son despojados de muscular propia y adventicia y la mucosa restante se pica y se sometieron a digestión enzimática con colagenasa y dispasa durante un máximo de 6 horas. Las células cultivadas expresan α-SMA y vimentina y desmina expresa débilmente o no en absoluto. Las condiciones de cultivo no son propicias para el crecimiento de origen epitelial, hematopoyético o células endoteliales. La pureza del cultivo se ve confirmado por citometría de flujo de evaluación de la superficie celular marcador expresión del potencial contaminante hematopoyéticas y las células endoteliales. La técnica descrita es sencillo y resulta en la generación consistente de no hematopoieitc, las células estromales no endoteliales. Limitaciones de esta técnica son inherentes a la utilización decultivos primarios en los estudios de biología molecular, es decir, la variabilidad inevitable encuentran entre las culturas establecidas a través de diferentes ratones o seres humanos. Los cultivos primarios sin embargo, son un reflejo más representativo del estado in vivo en comparación con las líneas celulares. Estos métodos también proporcionan los investigadores la capacidad para aislar y cultivar células estromales de diferentes condiciones clínicas y experimentales, lo que permite comparaciones entre grupos. Células estromales esofágicas caracterizados también se pueden utilizar en estudios funcionales que investigan las interacciones epitelio del estroma en los trastornos esofágicos.
Introduction
Interacciones epitelio-estroma están involucrados en la regulación de una variedad de funciones del tracto gastrointestinal incluyendo la regeneración de la mucosa, la reparación, la fibrosis y la carcinogénesis 1,2. Estas interacciones han sido mejor estudiado en el intestino delgado y el colon y pueden jugar un papel similar en los trastornos de la mucosa del esófago 3. Una subpoblación de células del estroma miofibroblastos intestinales y colónicas denominados se ha demostrado para participar en la mediación de la lesión tisular, inflamación y reparación de 4,5. En el tracto GI distal, estas células en forma de huso se encuentran adyacentes a la membrana basal en la interfaz entre el epitelio y la lámina propia y se definen como α-SMA y vimentina positivo, pan-citoqueratina negativa, y débilmente positivo o negativo 5 desmina.
El estroma de esófago no ha sido rigurosamente caracterizado a nivel celular o molecular. Nuestro trabajo en el esófago murino ha desdemostra- α-SMA células y vimentina en el estroma de esófago, de vez en cuando subyacentes al epitelio escamoso 6. Interacciones epitelio del estroma se han implicado en trastornos de la mucosa del esófago tales como lesión mediada 6 gastro-esofágica y esofagitis eosinofílica 3. Estenosis fibróticas también son una complicación conocida de las células del estroma y de lesiones esofágicas han sido implicados en la patogénesis de la fibrosis gastrointestinal. El aislamiento de estas células le ayudará a lograr los estudios necesarios para investigar vías de señalización trastornados.
Esta presentación ofrece las técnicas necesarias para establecer cultivos primarios de α-SMA, miofibroblastos positivas vimentina positivos tales que las lagunas existentes en el conocimiento sobre las vías de señalización que median estas interacciones se pueden abordar. La técnica descrita ha sido utilizado con éxito por los autores para establecer miofibroblastos de colon primarios murinos 7 y further adaptado para el establecimiento de murino 6 y las células del estroma de esófago parecidas a miofibroblastos humanos.
Aquí se describe las condiciones necesarias para establecer y caracterizar estas culturas establecidas de ratón o el esófago humano antes de su uso en futuros estudios funcionales. Las culturas pueden ser cultivadas y utilizadas para un máximo de 15 pasajes. El aislamiento y el establecimiento de cultivos primarios a través de los métodos descritos a continuación genera células estromales con un fenotipo myofibroblast; α-SMA, vimentina positivo, y débilmente positivo o negativo para desmina, y citoqueratina negativa. Este fenotipo es distinto del fenotipo de los fibroblastos de esófago que es predominantemente positiva vimentina, α-SMA negativo 3 o la α-SMA positivos, vimentina fenotipo negativo de la muscular de la mucosa 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas para la generación de cultivo primario son generalmente similares cuando se utiliza el tejido murino o humano con tiempos de digestión de picar carne y adaptados para el tamaño del tejido. Nuestra experiencia con el tejido murino sugiere que el uso de los métodos descritos anteriormente constantemente como resultado éxito del establecimiento de cultivos primarios. Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen la esterilización de material quirúrgico y siguiendo técnicas estériles estándar de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
Riferimenti
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