Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
Mürin ve insan özofagus miyofibroblastlar enzimatik sindirme ile oluşturulur. Yenidoğan (8-12 günlük) sıçangil yemek borusu, hasat kıyılmış, yıkandı ve 25 dakika boyunca kolajenaz ve dispaz ile enzimatik sindirme tabi tutulur. İnsan özofagus rezeksiyonu örnekleri muskularis propria ve adventisyanın elimden ve kalan mukoza kıyılmış edilir ve en fazla 6 saat kollajenaz ve dispase ile enzimatik sindirim tabi. Kültürlü hücreler α-SMA ve vimentinin ve ekspres desmin zayıf veya hiç ifade eder. Kültür şartları, epitel, hematopoietik, veya endotel hücrelerinin büyümesi için elverişli değildir. Kültür saflığı daha fazla potansiyel tehlike hematopoietik ve endotel hücrelerinin hücre yüzeyi işaretleyicisi ifade akış sitometrik değerlendirilmesi ile doğrulanır. Kullanılan teknik, basit ve non-hematopoetik olmayan endotel stromal hücrelerin sürekli üretimi ile sonuçlanır. Bu tekniğin Sınırlamalar kullanımına doğasında vardıryani moleküler biyoloji çalışmalarında, birincil kültürleri, kaçınılmaz değişkenliği farklı fareler ve insanlarda arasında kurulan kültürler arasında karşılaştı. Birincil kültürler, ancak hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında in vivo olarak durumunun daha iyi temsil yansımasıdır. Bu yöntemler ayrıca, araştırmacılar, gruplar arasındaki karşılaştırmalar sağlayan izole yeteneği, farklı klinik ve deneysel koşullardan elde edilen kültür stromal hücreler, sağlar. Özelliği özofagus stromal hücreleri, özofagus hastalıklarda epitelyal, stromal etkileşimlerinin araştırılması fonksiyonel çalışmalarda da kullanılabilir.
Introduction
Epitel-stromal etkileşimleri mukozal rejenerasyon, onarım, fibrozis, ve karsinogenezinde 1,2 olmak üzere gastrointestinal sistem fonksiyonları çeşitli düzenlenmesinde rol oynar. Bu etkileşimler en küçük bağırsak ve kolon incelenmiş ve benzer özofagus mukoza bozuklukları 3 rol oynayabilir. Bağırsak ve kolon stromal hücreler olarak adlandırılan rolü in bir alt popülasyonu, doku yaralanması, iltihaplanma aracı katılmak ve 4,5 onarmak için gösterilmiştir. Distal GI, bu iğ biçimli hücreler epiteli ve lamina propria arasındaki arayüzde bazal membran bitişik bulunan ve α-SMA ve vimentin olarak tanımlanan olumlu,-pan sitokeratin negatif ve zayıf pozitif veya negatif desmin 5.
özofagus stroma sıkı bir hücresel ya da moleküler düzeyde olmamıştır. Kemirgen özofagusta Çalışmalarımız de ettimonstrated α-SMA yassı epitel 6 bazen alttaki özofagus stromada ve vimentin hücreleri. Epitel-stromal etkileşimler gibi gastro-özofageal aracılı yaralanma 6 ve eozinofilik özofajit 3 gibi özofagus mukoza bozuklukları suçlanmıştır. Fibrotik darlıklar gastrointestinal fibrozis patogenezinde suçlanmıştır özofagus yaralanması ve stromal hücrelerin bilinen bir komplikasyonudur. Bu hücrelerin izolasyonu dengesiz sinyal yolları araştırmak için gerekli çalışmaları gerçekleştirmek yardımcı olacaktır.
Bu başvuru, bu etkileşimlerin aracılık sinyal yollar ile ilgili bilgi mevcut boşluklar ele alınabilir şekilde α-SMA pozitif, vimentin pozitif miyofibroblastlar birincil kültürleri kurmak için gerekli teknikleri sağlar. açıklanan teknik başarıyla birincil kemirgen kolon miyofibroblastlar 7 ve furthe kurmak için yazarlar tarafından kullanılmıştırr murin 6 ve insan miyofibroblast gibi özofagus stromal hücrelerin kurulması için uyarlanmış.
Bu yazıda kurmak ve fare veya gelecekteki fonksiyonel çalışmalarda kullanmak için önce insan özofagus kurulan bu kültürleri karakterize için gerekli koşulları açıklar. Kültürler büyütülür ve yukarı 15 geçişleri için kullanılabilir. Aşağıda gösterilen yöntemler aracılığıyla izole edilmesi ve primer kültürlerin kurulması miyofibroblast fenotip ile stromal hücreler oluşturur; , vimentin pozitif ve zayıf pozitif veya negatif desmin ve sitokeratin negatif-SMA α. Bu fenotip, ağırlıklı olarak vimentin pozitif olan özofagus fibroblast fenotipi, negatif α-SMA 3 veya müsküler mukozanın 6 α-SMA pozitif, vimentin negatif fenotipi ayrıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
doku boyutu için uyarlanmış kıyma ve sindirim kez sıçangil ya da insan doku kullanıldığında, birincil kültür oluşturulması için teknikler genellikle benzerdir. Sıçangil doku ile olan deneyim, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak sürekli olarak primer kültürlerinde başarılı bir şekilde kurulmasının neden olduğunu göstermektedir. Protokol kapsamında Kritik adımlar cerrahi ekipman sterilizasyon ve doku kültürü standart steril teknikler şunlardır. farelerin yaş da önemli bir ad?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
Riferimenti
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
