عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
يتم إنشاء الفئران والمريء البشري myofibroblasts عن طريق الهضم الأنزيمي. يتم حصاد الوليد (8-12 يوم من العمر) المريء الفئران، مفروم، وغسلها، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة 25 دقيقة. يتم تجريد العينات استئصال المريء الإنسان للالمخصوصة العضلية والبرانية ومفروم الغشاء المخاطي المتبقية، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة تصل إلى 6 ساعات. الخلايا المستزرعة تعبر α-SMA وفيمنتين وdesmin صريح ضعيفة أو لا على الاطلاق. الظروف الثقافة ليست مواتية لنمو طلائي، المكونة للدم، أو الخلايا البطانية. تأكيد ثقافة نقاء مزيدا من تدفق تقييم cytometric من سطح الخلية علامة التعبير من المحتمل المكونة للدم تلويث والخلايا البطانية. تقنية الموضحة واضح ومباشر والنتائج في جيل ثابت من غير hematopoieitc، خلايا انسجة غير البطانية. القيود المفروضة على هذه التقنية هي الملازمة لاستخدامالثقافات الأولية في دراسات البيولوجيا الجزيئية، أي تقلبات لا مفر منه اجه بين الثقافات أنشئت في جميع أنحاء الفئران أو البشر مختلفة. لكن الثقافات الأولية هي انعكاس أكثر تمثيلا للدولة في الجسم الحي بالمقارنة مع خطوط الخلايا. هذه الأساليب أيضا توفير المحققين القدرة على عزل والخلايا الثقافة انسجة من الحالات السريرية والتجريبية المختلفة، ويتيح إجراء مقارنات بين المجموعات. ويمكن أيضا خلايا انسجة المريء تتميز استخدامها في الدراسات وظيفية التحقيق التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المريء.
Introduction
وتشارك التفاعلات الظهارية اللحمية في تنظيم مجموعة متنوعة من الوظائف الجهاز الهضمي بما في ذلك تجديد الغشاء المخاطي، وإصلاح، والتليف، والتسرطن 1،2. وكانت هذه التفاعلات أفضل درس في الأمعاء الدقيقة والقولون وربما تلعب بالمثل دورا في اضطرابات المخاطية للمريء 3. وقد تجلى جزء من السكان من myofibroblasts الخلايا اللحمية المعوية والقولون ووصف للمشاركة في التوسط إصابة الأنسجة، والتهاب وإصلاح 4،5. في الجهاز الهضمي البعيدة، وهذه الخلايا المغزل على شكل يقع بالقرب من الغشاء القاعدي في واجهة بين الظهارة والصفيحة المخصوصة وتعرف بأنها α-SMA وفيمنتين إيجابية، لعموم cytokeratin سلبية، وإيجابية ضعيفة أو desmin سلبي 5.
لم يتميز سدى المريء بصرامة على المستوى الخلوي أو الجزيئي. عملنا في المريء الفئران وديmonstrated α-SMA وفيمنتين الخلايا في سدى المريء، تحتاني في بعض الأحيان إلى ظهارة الحرشفية 6. قد تورطت التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المخاطية للمريء مثل المعدي المريئي بوساطة إصابة 6 والتهاب المريء اليوزيني 3. القيود تليفي هي أيضا من المضاعفات المعروفة للخلايا الإصابة وانسجة المريء قد تورطت في التسبب في التليف الهضمي. سوف عزل هذه الخلايا تساعد في إنجاز الدراسات اللازمة للتحقيق في مسارات الإشارات مختل.
يوفر هذا التقديم التقنيات اللازمة لإنشاء الثقافات الأولية من α-SMA، myofibroblasts إيجابية فيمنتين الايجابية ان هذه الفجوات القائمة في المعرفة بشأن مسارات إشارات تتوسط هذه التفاعلات يمكن معالجتها. تقنية الموضحة وقد استخدم بنجاح من قبل المؤلفين لإنشاء الأولية myofibroblasts القولون الفئران (7) وابعد من ذلكص تكييفها لإنشاء الفئران وخلايا انسجة 6 المريء مثل الأرومة الليفية العضلية الإنسان.
هنا نحن تصف الشروط اللازمة لإنشاء وتميز هذه الثقافات أنشئت من الماوس أو المريء البشري قبل استخدامها في الدراسات الوظيفية المستقبلية. الثقافات يمكن زراعتها والاستفادة منها لمدة تصل إلى 15 الممرات. العزلة وإنشاء الثقافات الأولية عن طريق الأساليب المذكورة أدناه يولد خلايا انسجة مع النمط الظاهري الأرومة الليفية العضلية. α-SMA، فيمنتين إيجابي، وإيجابي ضعيف أو سلبي لdesmin، وcytokeratin سلبي. هذا النمط الظاهري يختلف عن النمط الظاهري من الخلايا الليفية المريء والتي هي في الغالب إيجابية فيمنتين، α-SMA سلبي 3 أو α-SMA إيجابي، فيمنتين النمط الظاهري السلبي للالعضلية المخاطية 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات لتوليد ثقافة الأساسي متشابهة عموما عند استخدام أنسجة الفئران أو الإنسان مع تنميق والهضم مرات تكييفها لحجم الأنسجة. تجربتنا مع الأنسجة الفئران تشير إلى أن استخدام الأساليب المذكورة أعلاه يؤدي باستمرار في إنشاء الناجح للثقافات الأولية. وتشمل الخطوات الحاسمة ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
Riferimenti
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
