Abstract
Regulação da síntese de proteínas representa um ponto de controlo chave na resposta celular ao stress. Em particular, os elementos reguladores discreta de RNA foram mostrados para permitir a tradução de mRNAs específicos selectiva, que tipicamente codificam para as proteínas necessárias para uma resposta de stress particular. A identificação destes mRNAs, bem como a caracterização dos mecanismos reguladores responsáveis pela tradução selectiva tem sido na vanguarda da biologia molecular, por algum tempo. Perfilamento polissoma é um método fundamental nestes estudos. O objetivo do polissoma profiling é capturar tradução do mRNA imobilizando ribossomos traduzindo ativamente em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos e aqueles mal traduzidas. Estes podem então ser ainda caracterizada por métodos tradicionais de biologia molecular e bioquímica. Importante, combinando polysome perfis com abordagens genómicas alto rendimento permite uma análise em larga escala de regulação de translação.
Introduction
Regulação da síntese de proteína (tradução) é um processo celular fundamental que está intimamente ligada à sobrevivência celular. Dado que a tradução consome mais de 50% da energia da célula, não é de estranhar que a tradução é rigidamente controlado e que as perturbações na tradução não são bem tolerados. Por outro lado, muitos processos celulares aberrantes que requerem maquinaria de tradução e a saída da tradução (isto é, proteoma) tem de ser modificado. Este é frequentemente o caso em vários estados de resposta ao estresse e doenças, e é provavelmente o melhor exemplificado no câncer. Uma vantagem chave do controlo translacional é a capacidade das células para reprogramar a saída rápida de proteína em resposta a vários disparadores internos e externos, assim mecanismo de ajuste fino que inclina o equilíbrio entre morte celular e sobrevivência 1.
Dois aspectos do controle de translação são particularmente interessantes; compreensão da natureza do mec regulamentarhanism (s) e elementos de controlo que permitem a tradução específico, bem como a identificação de mRNAs específicos e seus produtos proteicos que participam na resposta celular ao gatilho particular, que provocou a tradução selectiva em primeiro lugar. Perfilamento polissoma é uma técnica que permite o estudo eficaz de ambos os processos.
O objetivo geral da técnica polissoma profiling é estudar e quantificar o estado de tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. O princípio da técnica é capturar tradução do mRNA por '' congelar '' traduzindo ativamente ribossomos em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos (ligado por vários ribossomos) e os mal traduzido (ligado por um ou dois ribossomos). Neste protocolo particular, o antibiótico ciclo-heximida que se liga ao60S da subunidade ribossômica e bloqueia a liberação de desacetilados tRNA do local E ribossomo 2, é usado para inibir a translocação ribossomo e parar ribossomos em mRNAs de tradução. No entanto, outros agentes bloqueadores, tais como emetina, que também bloqueia a tradução de alongamento 3, podem ser utilizados.
Ao contrário da transferência western e 35 S-metionina técnicas de marcação que medem a saída final do processo de tradução, polissoma caracterização tem a vantagem de medir ribossomas associação com mRNAs activamente-traduzidas, permitindo, assim, para um estudo mais detalhado de mecanismos de tradução sob diferentes condições. Assim, a técnica pode ser facilmente adaptado especificamente para estudar a diferentes modos de tradução 4-6, factores de proteínas envolvidas na regulação de tradução 7-9, condições de stress que afectam a síntese de proteínas 1,10,11 ou os efeitos de estruturas de ARNm tais como IRES ou a montante quadros de leitura abertos no sintetizador de proteínasesis 12-14. Hoje em dia, polissomas aplicações de perfil são ainda mais ampla com o uso de microarranjos de DNA de 15 ou de próxima geração seqüenciamento 16,17 analisar polissomos-mRNAs associados.
Protocol
NOTA: Uma nota sobre o trabalho com RNA: Tome precauções padrão para proteger contra a degradação do RNA por RNases. Use luvas, pontas de pipeta barreira, plasticware livre de RNase e produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Use ou água ultrapura tratada com DEPC para todas as soluções. Descontaminar qualquer superfície suspeita com solução inativação RNase seguindo o protocolo do fabricante.
1. Preparação de Soluções.
- Prepare-se 500 ml de Solução básica (NaCl 0,3 M;. 15 mM MgCl 2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Misturar utilizando uma barra de agitação até que a solução é límpida e passar através de um filtro de 0,45 um. Guarde-o em temperatura ambiente.
- Preparar 10 e 50% de soluções de sacarose e 60% de solução Chase como segue:
- Para a solução de sacarose 10% (w / v), num tubo de centrífuga de 50 ml adicionam-se 5 g de sacarose e encher até 50 ml com solução básica. Para a solução de sacarose 50% (w / v), em um anúncio de tubo de 50 ml de centrífugad 25 g de sacarose e encher até 50 ml com solução básica.
- Para 60% (w / v) Solução Chase, em um tubo de centrífuga de 50 ml de adicionar 30 g de sacarose e encher até 50 ml com solução básica. Adicionar 100 ul de uma solução saturada de azul de bromofenol (adicionar à água de bromofenol azul até não mais vai dissolver; centrifugadora para granular o pó não dissolvido) à solução de perseguição 60%. Misturar utilizando um vórtice e verificar dissolução completa.
- Soluções Armazenar a 4 ° C até ser necessário.
- Preparar tampão de lise de ARN. Preparar esta tampão fresco no dia da experiência. Prepare-se 500 ul de tampão de lise de ARN para cada amostra. A 1 ml da solução básica adicionar 10 ul de Triton X-100 (1% [v / v] final), 1 ul de 100 mg / ml em DMSO ciclo-heximida (CHX, 0,1 mg / ml final) e 3,5 ul de RNasin (140 L / ml). Misturar utilizando um vórtice. Manter em gelo.
NOTA: cicloheximida é altamente tóxico e pode causar mutações. Evite contato com a pele e inalação. Para evitar manusear a forma de pó, muitas vezes, prepsão uma maior quantidade de 100 mg / ml em DMSO, alíquota e manter a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Manter estoque de trabalho à temperatura de -20 ° C. - O dia da experiência, preparar soluções de sacarose + CHX adicionando CHX (concentração final de 0,1 mg / mL) para o volume desejado de 10% e uma solução de sacarose a 50% (~ 7 ml de cada solução por gradiente).
2. Preparação de sacarose Gradiente Usando um Automated Gradiente Criador
- Ligue a máquina de gradiente '' ON '' e nivelar o prato que irá realizar a gradientes (criticalstep!) Clique em '' Done '' quando a placa está nivelado.
- Selecione no menu do programa de gradiente a ser executado:
- Prima 'menu' 'GRAD' e selecione '' LIST ''.
- Selecione "SW41".
- Role a lista e selecione a opção ''10 - 50% gradiente - 11 passos "programa" por imprensaing no botão '' RUN ''.
- Coloque um tubo cónico de ultracentrífuga (SW-41 do tubo, 14 x 89 mm) para o bloco marcador e usar o marcador fino tubo fornecido para traçar uma marca no tubo ao longo do degrau superior do bloco marcador. Coloque os tubos em um rack de montagem em uma superfície estável.
NOTA: Esta marca será o guia de preenchimento para mergulhar as soluções de sacarose 10 e 50%. - Fixe a cânula dois desde a duas seringas de 10 ml e lavar por pipetagem cima e para baixo com água destilada morna contendo solução inativação RNase. Certifique-se de remover todos os vestígios de água depois.
- Encha uma das seringas com 10% de sacarose + CHX e inserir a cânula na parte inferior do tubo de ultracentrífuga. Gentilmente dispensar solução a 10% de sacarose até que ele vai apenas após a marca feita no tubo.
NOTA: Evite fazer bolhas. Se surgirem bolhas, bata suavemente tubo para deslocá-los. - Encha a outra seringa com 50% de sacarose + CHX, limpe o líquido extra foracom uma limpeza e inserir uma cânula suavemente na parte inferior do tubo de ultracentrífuga. Suavemente administrar a solução de sacarose a 50% até atingir com precisão o sinal. Rapidamente e sem problemas remover a cânula.
NOTA: A sacarose a 10% deve subir no tubo e formar um menisco no topo. Se não, adicionar mais solução de sacarose a 10% na superfície. - Insira a tampa fornecida pela inclinação do tubo de ultracentrifugação ligeiramente e deslocando todas as bolhas de ar. Retire o excesso de líquido no reservatório da tampa com uma micropipeta.
- Limpe o excesso de líquido ao longo da parede do tubo e coloque no prato fabricante de gradiente.
- Pressione o botão '' RUN ''.
NOTA: A placa irá inclinar em um ângulo especificado, pausar por 5 segundos e as rotações para formar o gradiente começará. - Quando a formação de gradiente é completo (cerca de 2 minutos, a máquina emite um sinal sonoro), retire cuidadosamente a ultracentrifugação (s), local em rack e rapidamente retire a tampa em um movimento ascendente para evitar perturbar o gradient.
- Manter gradiente (s) em gelo. Não perturbe! Alternativamente, os gradientes manter durante a noite a 4 ° C.
- Como alternativa, use uma máquina de gradiente de duas câmaras para fazer gradientes da seguinte forma:
- Tubulação Rinse e máquina de gradiente com solução RNase inativação e água RNase-free.
- Adicionar 5 ml de 50% de sacarose + CHX a câmara proximal da fabricante de gradiente e garantir que todo o ar entre as duas câmaras é removido.
- Adicionar 5 ml de 10% de sacarose + CHX a câmara distal da fabricante de gradiente.
- Adicionar 0,5 ml de 50% de sacarose + CHX a parte inferior de um tubo de centrifugação cónico (SW-41 do tubo, 14 x 89 mm) e colocados no suporte de tubos.
- Ligue agitador colocado na câmara proximal, abertas torneiras de corte e gradiente de depósito na velocidade definida para "3" (cerca de 1 ml / min).
- Ponto de gradiente (s) em gelo. Não perturbe.
NOTA: Os gradientes podem ser mantidos durante a noite a 4 ° C.
3. A lise celular e Ultracentrifugação.
- Coloque SW-41 do rotor e baldes a 4 ° C e centrifugação definido para 4 ° C.
- Células da placa, na densidade celular apropriada no meio de crescimento, pelo menos, 24 h antes da lise.
- Prepara-se uma alíquota (20 ml por placa de 150 mm) de meio de crescimento contendo 0,1 mg / ml CHX.
- Incubar as células em meios de CHX + (20 ml por placa de 150 mm) por 3 min a 37 ° C / 5% de CO 2, a prender e estabilizar polissomas.
- Trabalhando de forma rápida, meios de aspirado das placas, as placas no lugar de gelo e lave as células uma vez com 10 mL de gelo frio de fosfato salino tamponado (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4) suplementado com CHX (concentração final de 0,1 mg / ml) tendo o cuidado de pipeta lentamente pelo side da parede do prato para minimizar a elevação da monocamada de células.
- Aspirar PBS e adicionar um adicional de 10 ml de PBS + CHX a cada placa, raspar células com um levantador de células e transferir o volume total de ambas as placas para um tubo de centrífuga de 50 ml em gelo. Reter 1 ml de suspensão celular num tubo de microcentrifugadora em gelo para análise de proteínas a jusante.
- Centrifugar o tubo de 50 ml de células a 300 xg a 4 ° C durante 10 min.
- Remova todo o PBS e ressuspender pellet em 500 mL de tampão de lise RNA gelada.
- Transferir suspensão de células para um tubo de microcentrifugação de 2 ml.
- Pipeta-se para baixo e para lisar as células e incubar em gelo durante 10 minutos com vortex ocasional.
- Centrifugar a 2.000 xg, a 4 ° C durante 5 min para sedimentar os núcleos.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 2 ml.
- Centrifugar a 17.000 xg, a 4 ° C durante 5 min para sedimentar os detritos celulares.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 2 ml e usar 2 ul para medirdensidade óptica a 260 nm (tampão de lise uso como em branco).
- Retirar 50 jul (10% do total) a partir de cada amostra para análise de ARN total. NOTA lisado pode ser armazenado a -80 ° C até ser necessário.
- Suavemente carregar unidades A260 iguais para cada gradientes de sacarose (10 min, OD OD óptimas 25, em um volume máximo de 500 ul;. Diluir lisado concentrada com tampão de lise adicional, se necessário).
- Garantir gradientes estão dentro de 0,1 g de cada um antes de ultracentrifugação.
- Gradientes de centrifugar a 39.000 rpm (260343 × g) durante 1,5 horas a 4 ° C.
- Durante spindown manter freio rotor em e desligá-lo durante a desaceleração quando se atinge 1.000 rpm.
NOTA: Esta etapa minimiza qualquer perturbação dos gradientes causadas por mudanças bruscas de aceleração como as cabeças da escova em contato com o rotor durante a frenagem.
NOTA: O procedimento de lise celular é optimizada para dois 150 milímetros subconfluentes (~ 70-80% confluente), as placas de células HEK293 por gradiente e os volumes utilizados podem ter de ser ajustada para diferentes linhas de células.
4. Gradiente Fracionamento Sistema Instrument Set-up.
- Set-up do instrumento e em branco os spectrophotometer com água como se segue:
- Ligue os componentes e permitir que a lâmpada para aquecer por pelo menos 15 min.
- Certifique-se de coletor de frações está definido para o método 'polissoma' (pressione duas vezes ícone da pasta; retorno seta duas vezes para voltar à tela inicial).
- Certifique-se a válvula do coletor de fração está definida para o lixo (seta apontando para o lixo ícone bin). Coloque um Erlenmeyer de 250 ml contendo água destilada sob o tubo de coleta de resíduos.
- Selecione as seguintes configurações no registrador gráfico: Conjunto de sensibilidade marcar a "LAMP e ótica SET"; coloque o interruptor do filtro de ruído para '1.5'; coloque o disco separador de pico para "OFF"; Gráfico definir a discagem rápida para '30 cm / h "(5 cm / 10 min); definir linha de base Ajuste de marcação (na parte superior do aparelho espectrofotômetro) para 'MAX aberta ".
NOTA: Opcional: Um software gravador digital pode ser usado em vez do registrador gráfico. No computador, clique em 'iniciar'. Uma janela será aberta aquisição: sob thmenu E Opções, desmarque a opção Pausar gráficos. Em Escala, definir os limites do gráfico de -10 e 100 (pode ser alterado on-the-fly durante a execução). Clique no botão Salvar para criar um novo arquivo e gravar a execução. - Coloque a seringa eo tubo na bomba e aperte no lugar (uso desde parafusos e chave Allen).
NOTA: Não aperte demais. - Encha a seringa com a solução de perseguição, utilizando o '' REV '' comando na velocidade rápida. Coloque a bomba em posição vertical e perseguir ar através do tubo usando a 'frente' 'comando'. Somente use RAPID para esta função e lavagens.
- Instale um tubo de ultracentrifugação preenchido com água livre de RNase.
- Pierce o tubo de ultracentrífuga com a cânula até que as duas marcas pretas são visíveis (o orifício de distribuição está localizado entre esses dois valores) e a bomba de seringa no '' Manual '', em 6,0 ml / min.
- À medida que a água passa através da célula de fluxo (c quandohase solução enche o tubo de 1/3), a velocidade de mudança para definir a variável e 1,0 ml / min.
- A uma taxa de fluxo de 1,0 ml / min, ajustar a linha de base Ajuste de marcação no espectrofotómetro até que a tensão no gráfico é a zero (+/- 0,5 unidades).
NOTA: Observe a saída de água do tubo de descarga no Erlenmeyer. - Defina a sensibilidade pretendida para "0,5" ou "1,0" AU.
NOTA: 1,0 UA funciona melhor para 10 unidades OD em um gradiente de 10 ml. Se OD é menor do que 10, "0,5" sensibilidade pode ser utilizado para melhorar o sinal. - Aperte o botão Auto de linha de base e ajuste a configuração para a marca de 10% sobre o registrador gráfico de linha de base, girando o dial Recorder offset (opcional se usar gravador digital).
- Uma vez que uma linha de base estável é alcançado, ligue o interruptor da bomba para "OFF" eo mostrador gráfico velocidade 60 cm / h se estiver usando o registrador gráfico analógico ou 'OFF' se estiver usando o gravador digital.
- Recuperar a Solução perseguição por comutação da bomba para "REPosição V '(se necessário pode-se aumentar a taxa de fluxo de volta para 6,0 ml / min ... NÃO USE RAPID) até que ele atinja a primeira marca de perfuração na cânula.
- Retire o tubo de centrífuga e perseguir as bolhas de ar no interior da cânula, executando um pouco da solução de perseguição por ele. Limpe a limpo fase piercing.
NOTA: Um pouco de água residual pode vazar da célula de fluxo.
5. Gradiente Fracionamento e Coleta de Amostras.
- Instalar e furar o tubo de centrífuga contendo o gradiente de sacarose.
- Coloque onze 2 ml microtubos nas posições de bandeja coletor fração 1-11 de tal forma que as tampas não se projetam para cima. Substitua '' tubo # 1 '' por enquanto com um '' tubo de resíduos '' para recolher o líquido deixado na tubulação do coletor.
- Ajuste o seletor de controle da bomba para 'Manual' e vazão da bomba de seringa para '6,0 ml / min' Pressione o ícone "Play" no coletor de fração. Assim que o braço atinge o primeiro tubo, pressione o botão de "'pausa' '(isto irá posicionar o braço e abrir a válvula de distribuição de fracção).
- Comece a bomba usando o 'comando' 'para frente' e monitorar Gráfico caneta gravador. Quando ele começa a desviar para cima (indicando que a amostra passa através da célula de fluxo do espectrofotômetro), substituir rapidamente '' tubo de resíduos '' com '' tubo # 1 ''.
- Quando a primeira gota é coletado, alternar rapidamente comandos para 'ícone' start / stop remoto ',' 'Variável (1,0 ml / min)' 'e pressione' 'Play'.
NOTA: A bomba é agora controlado pela interface coletor de frações e 1 ml frações serão coletadas a cada min. - Deste ponto em diante, as leituras A260 aparecerá na interface do gravador digital (ou o Recorde gráfico analógicor). Verifique se o '' Record '' botão no software é pressionado!
- Após a solução perseguição azul entra no tubo de coleta ou o último tubo (geralmente tubo 11), pressione o ícone 'Stop'.
NOTA: A válvula de distribuição deve mudar para a válvula de resíduos. - Mantenha frações no gelo até que todos os gradientes foram fracionados. No final das fracções dia pode ser armazenado a -80 ° C antes do isolamento do ARN ou proteína. Se for necessária uma análise de proteína e RNA, dividir cada fracção em meia (500 ul para cada proteína e análise de RNA).
6. Lave
NOTA: (este passo é opcional apenas para ser executada se vários gradientes devem ser recolhidos).
- Submergir o tubo de descarga para o balão de Erlenmeyer contendo ~ 50 ml de água ultrapura e inverter a bomba usando um caudal de 6 ml / min.
- Parar a bomba quando a solução atinge a perseguição primeira marca on cânula piercing.
- Remover o tubo de centrífuga, perseguir todo o ar para fora da cânula e limpar a fase de perfuração.
NOTA: Um pouco de água residual pode vazar da célula de fluxo. - Repita o procedimento de fracionamento começando no passo 5.1.
7. final de limpeza.
- Desligue o tubo de bomba a partir do fundo do furador e bombear a solução de perseguição em um tubo de centrífuga de 50 ml usando a configuração de fluxo rápido. Armazenar a Solução Chase em 4 ° C, uma vez que pode ser reutilizado.
- Ligar a bomba de tubo de um sistema de tubagem de 3 vias e fechar a válvula que conduz à seringa. Conectar um tubo a uma seringa de 50 ml cheia com água destilada e o outro tubo para a base do furador.
- Instale o tubo de ultracentrifugação utilizada para a etapa de supressão e passar pelo menos 50 ml de água destilada através do espectrofotômetro e tubo de coleta (alternar para menu de coleção na interface, clicando no '' Start / Pause '' ícone).
- Retire o tubo, seringa (uso de chave Allen para remover os parafusos) e todos os outros componentes removíveis e lave bem com água morna e depois enxaguar com água ultrapura.
NOTA: Tome especial cuidado ao lavar o êmbolo, cilindro, tubulação e piercing cânula.
NOTA: Lidar com o corpo da seringa de vidro com cuidado! Guarde todos os componentes longe da poeira. - Limpe inferior da célula de fluxo com um pano macio umedecido com água destilada. Limpe a bandeja do coletor de frações e quaisquer outras áreas em que a sacarose pode ter sido derramados.
8. Isolamento de ARN a partir de fracções de sacarose.
- Preparar 50 ml de solução de proteinase K por cada ml de uma fracção de sacarose (37,5 ul de 10% SDS, 7,5 ul de EDTA 0,5 M, 1 ul Glycoblue, 4 ul de 20 mg / ml de Proteinase K).
- Em 2 ml de tubo de fundo plano, incubar 1 ml de fracção de sacarose com 50 ul de solução de proteinase K a 55 ° Cpara 1 hora (se estiver usando 500 frações ul ajustar o volume de solução de proteinase K em conformidade).
- Adicionar um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (125: 24: 1, de preferência ácido (pH 4,5) para minimizar a contaminação de ADN) para as fracções de sacarose.
NOTA: Adicionar um extra de 200 mL de clorofórmio para frações 7-10 porque eles são mais pesados e fases poderia se invertido.
NOTA: fenol / clorofórmio pode causar queimaduras no contato e inalação. Usar bata de laboratório, óculos de segurança, e usar um fumehood. - Vortex ~ 30 seg e centrifuga-se à velocidade máxima durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover ~ 80-90% de fase aquosa (não toque interfase que pode conter DNA genômico) e colocar em novo tubo.
- Adicionar um volume igual de clorofórmio e repita o passo 8.4.
- Remover fase aquosa tendo o cuidado de evitar a interfase.
- Adicionar 1:10 volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 (alternativamente, 5 M de acetato de amónio pode ser utilizado).
- Adicionar 1,5 volumes de refrigerada, absoluetanol te e vortex por 15 s.
- Precipitar durante a noite a -20 ° C (ou 1 h a -80 ° C, se em uma corrida).
NOTA: As amostras podem ser mantidas em -20 ° C durante mais tempo, se necessário. - Centrifugar a uma velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C.
- Lava-se a pelete com 1 ml de refrigerada livre de RNase etanol a 70%.
- Ar secar o sedimento e ressuspender em 20 uL de água sem RNase.
- Quantificar ARN total por espectrofotometria de assegurar um rendimento e pureza (com base na A260 / rácio 280) adequada e proceder com a norma análise de RT-qPCR utilizando 14 volumes iguais de cada fracção e os iniciadores de PCR específicos para o ARNm (s) de interesse.
9. Isolamento de Proteínas a partir de fracções de sacarose.
- Além de RNA, as proteínas podem ser isoladas e identificadas em fracções individuais, bem polissomas. Use um dos muitos excelentes protocolos disponíveis para o isolamento das proteínas, por exemplo, 18.
Representative Results
Descrevemos recentemente um novo papel para o supressor de tumor PDCD4 como um inibidor selectivo de tradução de mRNAs que codificam inibidores apoptóticos XIAP e Bcl-xL 12 IRES-abrigando. Perfilamento polissoma foi uma técnica chave para demonstrar o envolvimento específico de PDCD4 na tradução IRES-mediada. As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente para esgotar os níveis endógenos de PDCD4 (Figura 1A) e, em seguida, submetido a análise do perfil de polissoma. Observou-se que a redução dos níveis de PDCD4 não prejudicou tradução celular global, a julgar pela falta de mudanças no perfil polissoma quando comparando siCTRL e siPDCD4 células tratadas (Figura 1B). De modo semelhante, a distribuição de polissoma variante não-IRES de XIAP 19 permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em contraste, polissoma distribuição dos mRNAs dois IRES-albergando, XIAP e Bcl-xL, foi significativamente alterada. Na ausência de PDCD4 a distribuição destes dois mRNAs é deslocada para dentro ribopolysomes pesados (Figura 1D, E). Uma vez que este não é acompanhada por alterações nos níveis de estado estacionário de XIAP e Bcl-xL de mRNA (Figura 1F), estes resultados demonstram tradução de XIAP e Bcl-xL reforçada em células com níveis PDCD4 reduzidas, que foi posteriormente confirmada por Western blot (Figura 1G).
Figura 1:. Perfilamento polissoma identifica PDCD4 como inibidor selectivo de XIAP e Bcl-xL tradução (A) HEK293 células foram tratadas com siRNA PDCD4 ou controlo (CTRL), não-alvo siRNA, lisadas e sujeitas a análise de Western blot com anti-PDCD4 e anticorpos anti-nucleolina para verificar a extensão da PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 foi derrubado como em (A) eOs lisados celulares foram sujeitos a polissoma perfilamento. Polissoma perfil representativo é mostrado no painel de topo; a distribuição de XIAP não-IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) em relação ao ARNm que de GAPDH é mostrada como a percentagem de ARNm total (ARNm%) em cada fracção. (F) Firme Os níveis de ARNm -State foram medidas por RT-qPCR em PDCD4 siRNA ou de controlo (CTRL) siRNA células tratadas. (G) Os lisados a partir de (A) foram também submetidas à análise de Western blot com anti-XIAP, anti-Bcl-x, e Os anticorpos anti-nucleolina. (NB. Os dados apresentados na Figura 1 foram originalmente publicado em 12) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Perfilamento polissomal é uma técnica poderosa que permite a quantificação do estado da tradução de transcritos específicos sob diferentes condições de tratamento. É uma técnica muito simples, em princípio, no entanto, requer várias etapas de execução, alguns dos quais são críticos para produzir bons perfis de polissomas. Estes passos principais são: 1) uso de produtos químicos RNase e de plástico, 2) a preparar bons gradientes de sacarose (em nossa experiência de 10-50% gradientes de sacarose funcionar melhor para resolver de forma eficiente 40 / 60S subunidades e mRNAs com ribossomos ligadas), e 3 ) utilizando células que estão em crescimento exponencial e não confluentes mais do que 80%, a fim de capturar as maiores taxas de tradução. Este último passo deve ser tomado em consideração quando se faz tratamentos celulares longos, tais como o knockdown ou a sobre-expressão do gene, de modo que a quantidade de células a placa será uma função da quantidade de células vão ser confluentes no final do estudo.
Nos resultados da presented aqui, polissoma análise do perfil era uma ferramenta importante para avaliar o papel de PDCD4 na regulação tradução dos IRES-abrigando mRNAs XIAP e Bcl-xL 12. O fato de que nós não observamos qualquer mudança nos perfis gerais polissomas sobre PDCD4 knock-down (Figura 1B) permitiu-nos concluir que PDCD4 não prejudicou tradução celular mundial nas condições do experimento. A seguir, utilizaram a análise de RT-qPCR para determinar a distribuição do XIAP e Bcl-xL ARNm em células tratadas com PDCD4 ou siRNAs de controlo. qPCR é um método de escolha para a análise de perfis de polissomas, em oposição ao padrão de RT-PCR ou Northern blotting, uma vez que permite uma análise quantitativa ao invés de semi-quantitativa da distribuição de ARNm e para a detecção de mudanças subtis na eficiência de translação entre os tratamentos. Usando esta técnica, fomos capazes de mostrar que a distribuição dos XIAP e Bcl-xL mRNAs (expresso como uma percentagem do total de mRNA-alvo em todo o gradient) foi significativamente deslocado para polirribossomas pesados (mRNAs com um grande número de ribossomas associados com eles) após PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando, assim, um aumento na tradução destes mRNAs. Isto foi ainda confirmado por um aumento em XIAP e Bcl-xL, mas os níveis de proteína não nos seus níveis de ARN de estado estacionário (Figura 1F, G). É importante notar que a distribuição de polissoma a variante não-IRES de XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em alternativa, a eficiência de translação pode ser apresentada como uma proporção do teor de ARNm em polissomas (geralmente fracções 5 a 10) contra monosomes (geralmente frações 2-4) 14.
O uso de controles durante todo o protocolo é importante para validar qualquer polissoma perfis resultado, como picos observados a partir de leituras de absorbância a 254 nm não pode em seu próprio ser atribuído ao RNA ribossomal (detergentes, tal como Triton X-100 absorvem fortemente nesta regi do espectro e pode obscurecer 40 / 60S picos no topo do gradiente). Gradientes em branco sem ligado e / ou com tampão de lisado precisa ser executado para determinar a contribuição relativa dos buffers para a absorvância a 254 nm. Artefactual estruturas de ordem superior também pode levar a interpretações errôneas dos polissomos onde há de fato nenhum (por exemplo, "pseudo-polissomos" 20). Sequestrar de magnésio (usado durante todo o procedimento para estabilizar ribossomas 80S) com o catião bivalente quelante EDTA adicionado ao lisados e para o buffer de gradiente (20 mM durante 15 min) vai provocar a separação do ribossoma nos seus componentes pequenos (40S) e grandes (60S subunidades). Assim, se os picos de absorvância registados a 260 nm polissomas são, de facto, o tratamento com EDTA vai entrar em colapso o perfil de tal modo que uma única máxima vai ser observada perto do topo do gradiente que corresponde a libertar o ARNm e unidades ribossomais (dados não mostrados). Coincidentecom colapso induzido pelo EDTA do perfil, todos os alvos específicos analisados por qPCR agora deve ser encontrada no topo do gradiente.
O número de ribossomas associados a um ARNm não é sempre um indicador de quão eficiente de ARNm em particular que está a ser traduzida. Na verdade, existem contextos específicos em que a tradução se torna ativo em polissomos paralisadas 21,22 que o leitor deve estar ciente. Determinar se ou não transcritos estão activamente envolvidos com a maquinaria de tradução pode ser realizado por a) tratar a amostra com puromicina, que ao contrário de EDTA, faz com que "run-off 'de ribossomas que estão activamente a translocação através de um mRNA, ou b) o tratamento da amostra com homoharringtonina que inibe a translocação de apenas a primeira ribossoma no codão de iniciação, de novo causando 'off-correr "de quaisquer ribossomas translocar a jusante.
O uso dos transcritos de controlo para análise qPCR também é crítico. A selecção de transcritos que não são afectados pelas diferentes condições de tratamento, tais como alguns genes de manutenção (GAPDH, actina, tubulina, nucleolina), ARNm ribossómicos, RPL13A (18S) ou, neste caso, a variante não-IRES do IRES de XIAP, é importante na verificar se o efeito do tratamento sobre a tradução é específica ou generalizada. Estes transcritos de controlo pode ser utilizado para normalizar a distribuição dos mRNAs analisada como foi feito aqui (XIAP e Bcl-xL mRNAs foram normalizadas para GAPDH mRNA e expresso como uma percentagem do conteúdo total de ARNm representado pela soma do teor de ARNm em cada fracção ) ou, alternativamente, os ARNm alvo e de controlo podem ser expressos como valores absolutos e mostrada separadamente. análise qPCR dos lisados de entrada (geralmente 10% do volume total) é uma outra etapa que vai controlar a distribuição de mRNAs específicos. Idealmente, o conteúdo de um transcrito de ARNm específico no lisado de entrada deve ser comparável à soma do teor de ARNm em todas as 10 fracções analisadas. Finalmente, Um passo opcional para controlar o fenol: clorofórmio passo de extracção é a espiga cada fracção com um ARNm de polissoma repórter transcrito in vitro (tal como CAT, cloranfenicol acetil-transferase) que irá ser subsequentemente quantificados por qPCR e pode até mesmo ser utilizados para normalizar o dados 14.
Como acontece com qualquer técnica, o profiling polissoma apresenta algumas limitações. O facto de normalmente um mínimo de 10 fracções (turnos de mais subtis em termos de eficiência de tradução podem exigir 20 ou mais) precisam de ser recolhido, a fim de ter distribuições de polissomas agradáveis torna este passo limitante, no sentido de que apenas um máximo de 4 amostras pode ser analisados de cada vez para ser capaz de lidar confortavelmente extracção de ARN e análise de qPCR de 40 amostras e os controlos de entrada 4 ao mesmo tempo. O tamanho da amostra pode facilmente adicionar até com quantos transcrições devem ser analisados e quantos qPCR replica para fazer, e isso pode ser caro. Outra limitação de um polissomal profiling uma base-qPCRnálise é que ela só pode ser feito em uma abordagem baseada no candidato (onde os transcritos para serem analisados são conhecidos de antemão) e não pode ser aplicado para a análise de todo o genoma de tradução. No entanto, no início do século 21, os investigadores começaram a interrogar o seu RNA polissomal em nível genômico usando DNA microarrays 15 e, mais recentemente, com a próxima geração de sequenciamento 16,17. Nesta abordagem poderosa, perfilamento polissomal é realizado como descrito no presente protocolo, excepto que em vez de efectuar a análise de qPCR de fracções individuais, monosomes fracções (geralmente de fracções 2-4) e polissomas fracções (normalmente fracções) são reunidas em conjunto e variações globais na tradução analisados por microarray de DNA ou todo o genoma RNA seqüenciamento. Assim, com esta abordagem, é possível avaliar todos os mRNAs cuja distribuição turnos de polissomos para monosomes (diminuição na tradução), ou vice-versa (aumento na tradução) após um tratamento específicomento. Validação e quantificação de ARNm específico polissomas distribuição pode, então, ser feito por qPCR. Um uso ainda mais poderoso do princípio da polissomal perfil é profiling ribossomo. Nova prorrogação alto rendimento desta técnica foi relatado recentemente que permite o monitoramento simultâneo de centenas de polissomas frações 23. Isso proporciona uma clara vantagem quando sondagem eficiência de translação de coleções mutantes ou em telas de RNAi em larga escala. Profiling ribossomo é uma técnica que aproveita a próxima geração de sequenciamento para mapear fragmentos de RNA protegidas por ribossomos (pegadas ribossomo) envolvidos na síntese de proteínas 24,25. Nesta técnica, a translocação do ribossoma pode ser inibida com ciclo-heximida (reversíveis) ou emetina (irreversível), seguida por lise celular e digestão de RNase para produzir uma população de pegadas ao ribossoma. Os ribossomas são enriquecidos, o ARN total é isolado, e contaminando ribossomal e RNA ribossomal mitocondrial é removido.Pegadas de RNA de aproximadamente 26-28 nucleotídeos são isolados, transcrição reversa, convertida em uma biblioteca de cDNA e seqüenciados 26. Ao contrário de perfis polissoma padrão, esta abordagem não só identifica mRNAs específicos que são regulados em translação, mas também fornece informações mRNA específico da resolução no códon tais como a ocupação exata e densidade dos ribossomos ao longo de uma transcrição específica. Isto é particularmente interessante para mRNAs com modos específicos de tradução, como mRNAs IRES-abrigam, como poderia dar mais informações sobre onde na transcrição ribossomo-recruitment está ocorrendo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J.
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
