Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av Selektiv mRNA Oversettelse i pattedyrceller ved Polysome Profiling

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/52295
Automatic Translation
1, 2, 3
1Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Montreal Neurological Institute, 3Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Pediatrics, University of Ottawa

Abstract

Regulering av proteinsyntese representerer et nøkkelkontrollpunkt i cellulær respons på stress. Spesielt ble diskret RNA regulatoriske elementer vist å tillate selektiv oversettelse av bestemte mRNAer, som typisk koder for proteiner som er nødvendige for en bestemt stressrespons. Identifisering av disse mRNA, samt karakterisering av regulatoriske mekanismer ansvarlig for selektiv oversettelsen har vært i forkant av molekylær biologi i noen tid. Polysome profilering er en hjørnestein metode i disse studiene. Målet med polysome profilering er å fange mRNA oversettelse ved immobilisering aktivt sette ribosomer på ulike transkripsjoner og skille de resulterende polyribosomes ved ultrasentrifugering på en sukrosegradient, og dermed gir for et skille mellom høyt oversatte utskrifter og dårlig oversatte seg. Disse kan deretter bli ytterligere karakterisert ved tradisjonelle biokjemiske og molekylærbiologiske metoder. Viktigere, kombinere polysome profilering med høy gjennomstrømning genomiske fremgangsmåter gjør det mulig for en stor skala-analyse av translasjons-regulering.

Introduction

Regulering av proteinsyntese (oversettelse) er en viktig cellulær prosess som er nært knyttet til mobilnettet overlevelse. Gitt at oversettelsen forbruker mer enn 50% av cellens energi, er det ikke overraskende at oversettelsen er strengt regulert, og at forstyrrelser i oversettelse ikke er godt tolerert. Omvendt, mange avvikende cellulære prosesser krever at oversettelsen maskiner og oversettelse utgang (dvs. proteom-) må endres. Dette er ofte tilfellet i ulike stressrespons og sykdomstilstander, og er trolig best eksemplifisert i kreft. En viktig fordel med translasjons-kontroll er evnen til cellene til å omprogrammere hurtig protein-utgang i respons til ulike eksterne og interne triggere, og dermed finjustering mekanisme som tips balansen mellom celle-overlevelse og død 1.

To aspekter av translasjonell kontroll som er interessant; forståelse av naturen av regelverket mechanism (e) og kontrollelementer som gir mulighet for omregning bestemt, og identifisering av spesifikke mRNA og deres proteinprodukter som deltar i cellulær respons på den bestemte trigger som fremkalte selektiv translasjon i det første sted. Polysome profilering er en teknikk som gjør det mulig effektiv studie av begge prosessene.

Det overordnede målet med polysome profilering teknikk er å studere og kvantifisere oversettelsen tilstand av spesifikke mRNA under ulike cellulære forhold. Prinsippet om teknikken er å fange mRNA oversettelse av '' fryse '' aktivt sette ribosomer på ulike transkripsjoner og skille de resulterende polyribosomes ved ultrasentrifugering på en sukrosegradient, og dermed gir for et skille mellom høyt oversatte transkripsjoner (bundet av flere ribosomer) og dårlig oversatt de (bundet av en eller to ribosomer). I dette spesielle protokoll, antibiotika cykloheksimid som binder til60S ribosomale subenhet og blokkerer frigjøring av deacetylert tRNA fra ribosomet E området 2, blir brukt til å inhibere ribosom-translokasjon og stall ribosomer på å oversette mRNA. Imidlertid kan andre blokkerende midler som for eksempel emetine som blokkerer også oversettelses forlengelse 3, kan brukes.

I motsetning til den vestlige blotting og 35 S-metionin merkingsteknikker som måler det endelige resultatet av oversettelsesprosessen, polysome profilering har fordelen av å måle ribosomer assosiasjon med aktivt-oversatte mRNA, og dermed åpner for en mer detaljert studie av oversettelsesmekanismer under forskjellige forhold. Derfor kan den teknikk som lett kan tilpasses til å spesifikt studere forskjellige moduser av oversettelses 4-6, proteiner, faktorer som er involvert i regulering av oversettelses 7-9, stressbetingelser som påvirker proteinsyntesen 1,10,11 eller virkningene av mRNA-strukturer som IRES eller oppstrøms åpne leserammer på protein synthesis 12-14. I dag, polysome profilerings programmer er enda bredere med bruk av DNA-mikromatriser 15 eller neste generasjons sekvense 16,17 å analysere polysomes-forbundet mRNA.

Protocol

MERK: Et notat om arbeidet med RNA: Ta vanlige forholdsregler for å beskytte mot RNA degradering av RNases. Bruk hansker, barriere pipettespisser, RNase-frie plasticware og kjemikalier i alle trinn i protokollen. Bruk ultrarent eller DEPC-behandlet vann for alle løsninger. Decontaminate eventuelle mistenkte flater med RNase inaktiveløsningen etter produsentens protokoll.

1. Utarbeidelse av løsninger.

  1. Forbered 500 ml basisk oppløsning (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl2 6H O 2; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Bland ved hjelp av en røre bar inntil oppløsningen er klar og passerer gjennom et 0,45 mikrometer filter. Oppbevares i romtemperatur.
  2. Forbered 10 og 50% sukrose Solutions og 60% Chase løsning som følger:
    1. For 10% sukroseløsning (w / v), i et 50 ml sentrifugerør tilsett 5 g sucrose og fyll opp til 50 ml med basisk løsning. For 50% sukroseløsning (w / v), i et 50 ml sentrifugerør add 25 g sukrose og fyll opp til 50 ml med Basic Solution.
    2. For 60% (w / v) Chase Solution, i en 50 ml sentrifugerør legge 30 g sukrose og fyll opp til 50 ml med Basic Solution. Tilsett 100 ul av mettet bromfenolblått-oppløsning (legg til bromfenol blå til vann inntil ikke mer vil oppløse; sentrifuge for å pelletere uoppløst pulver) til 60% chase løsning. Bland ved hjelp av en vortex og verifisere fullstendig oppløsning.
    3. Butikkløsninger ved 4 ° C inntil nødvendig.
  3. Forbered RNA lysisbuffer. Forbered denne bufferen frisk på dagen for forsøket. Forbered 500 ul lyseringsbuffer RNA for hver prøve. Til 1 ml av basiske oppløsning tilsettes 10 ul Triton X-100 (1% [v / v] slutt), 1 ul av 100 mg / ml cykloheksimid i DMSO (CHX, 0,1 mg / ml sluttkonsentrasjon) og 3,5 ul RNasin (140 U / ml). Bland ved hjelp av en vortex. Hold på is.
    MERK: Cycloheximide er svært giftig og kan føre til mutasjoner. Unngå hudkontakt og innånding. For å unngå å håndtere pulverform for ofte, preper en større mengde på 100 mg / ml lager i DMSO, delmengde og holde ved -80 ° C for langtidslagring. Fortsette arbeidet lager ved -20 ° C.
  4. Den dagen for eksperimentet, forberede Sukrose + CHX løsninger ved tilsetning av CHX (sluttkonsentrasjon på 0,1 mg / ml) til det ønskede volum på 10% og 50% sukrose-oppløsning (~ 7 ml av hver oppløsning pr gradient).

2. Utarbeidelse av Sukrose Gradient Bruke en Automated Gradient Maker

  1. Snu gradient maker '' PÅ '' og vatre plate som vil holde gradienter (criticalstep!) Klikk på '' Ferdig '' når platen er jevnet.
  2. Velg på menyen graderingen program som skal kjøres:
    1. Trykk '' GRAD '' menyen og velg '' LIST ''.
    2. Velg "SW41".
    3. Bla gjennom listen og velg ''10 - 50% stigning - 11 trinn' 'program ved å trykkeing '' RUN '' knappen.
  3. Plasser en konisk ultrasentrifugerør (SW-41 rør, 14 x 89 mm) i Marker Block og bruke den medfølgende fin tube markør for å spore et merke på røret langs den øvre trinnet i Marker Block. Plasser rørene i en passende stativ på et stødig underlag.
    MERK: Dette merket vil være fylle guide for lagdeling de 10 og 50% sukrose løsninger.
  4. Fest de to gitt kanyle til to 10 ml sprøyter og vask ved å pipettere opp og ned med varmt destillert vann som inneholder RNase inaktive løsning. Sørg for å fjerne alle spor av vann etterpå.
  5. Fyll en av sprøyter med 10% sukrose + CHX og sette kanylen ved bunnen av den ultrasentrifugerør. Forsiktig dispensere 10% sukroseløsning før det går bare forbi merket gjort på røret.
    MERK: Unngå å lage bobler. Hvis det dannes bobler, banke forsiktig på røret for å fortrenge dem.
  6. Fyll den andre sprøyte med 50% sukrose + CHX, tørk ekstra væske offmed en tørker og forsiktig setter kanylen i bunnen av ultrasentrifugerør. Forsiktig dispensere 50% sukrose-løsning inntil den når nøyaktig mark. Raskt og greit fjerne kanylen.
    MERK: 10% sukrose bør stige i røret og danner en menisk på toppen. Hvis ikke, tilsett mer 10% sukkrose-løsning ved overflaten.
  7. Sett den medfølgende hetten ved å vippe ultrasentrifugerør litt og fortrenge alle luftbobler. Fjern overflødig væske i hatten reservoar med en mikropipette.
  8. Tørk overflødig væske langs rørveggen og sted på gradient maker plate.
  9. Trykker du på '' RUN '' knappen.
    MERK: Platen vil vippe på angitt vinkel, pause i 5 sek og rotasjonene til å danne gradienten vil begynne.
  10. Når gradient formasjonen er ferdig (ca 2 min, piper maskinen), fjern forsiktig ultrasentrifugen (e), sted på rack og hurtig fjerne hetten i en oppadgående bevegelse for å unngå å forstyrre gradient.
  11. Hold gradient (r) på isen. Ikke forstyrr! Alternativt gradienter holde natten ved 4 ° C.
  12. Alternativt kan du bruke en to kammer gradient maker å lage gradienter som følger:
    1. Skyll slangen og gradient maker med RNase inaktive løsning og RNase-fritt vann.
    2. Tilsett 5 ml 50% sukrose + CHX til proksimal kammer av gradient trakter og sikre at eventuell luft mellom de to kamre er fjernet.
    3. Tilsett 5 ml 10% sukrose + CHX til distal kammer av gradient maker.
    4. Tilsett 0,5 ml 50% sukrose + CHX til bunnen av en konisk sentrifugerør (SW-41 rør, 14 x 89 mm) og plasser i rørholder.
    5. Slå på røre plassert i proksimale kammer, åpne stop-kuker og innskudd gradient i fart satt til "3" (ca 1 ml / min).
    6. Sted gradient (r) på is. Ikke forstyrr.
      MERK: Gradienter kan holdes over natten ved 4 ° C.

3. Cell Lysis og Ultrasentrifugering.

    Plasser SW-41 rotor og bøtter ved 4 ° C og satt til sentrifugen 4 ° C.
    MERK: cellelyseprosedyren er optimalisert for to 150 mm Subkonfluente (~ 70-80% sammenflytende) plater av HEK293 celler pr gradient, og de volumer som benyttes kan være nødvendig å justere for forskjellige cellelinjer.
  1. Plate cellene ved det passende celletetthet i vekstmediet i minst 24 timer før lysis.
  2. Tilbered en aliquot (20 ml pr 150 mm skål) i vekstmedium inneholdende 0,1 mg / ml CHX.
  3. Inkuber cellene i CHX + media (20 ml pr 150 mm skål) i 3 minutter ved 37 ° C / 5% CO2 for å arrestere og stabilisere polysomes.
  4. Arbeider raskt, aspirer media fra platene, sted platene på is og cellene vaskes en gang med 10 ml iskald fosfatbufret saltløsning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) supplert med CHX (endelig konsentrasjon på 0,1 mg / ml) er forsiktig med å pipettere sakte nedover side av fatet veggen for å minimere løfting av cellemonolag.
  5. Aspirer PBS og tilsett ytterligere 10 ml PBS + CHX til hver plate, skrape celler med en celle løfteren og overføre det totale volum fra begge platene til et 50 ml sentrifugerør på is. Beholder 1 ml av cellesuspensjonen i et mikrosentrifugerør på is i nedstrømsproteinanalyse.
  6. Sentrifuger 50 ml tube av cellene ved 300 x g ved 4 ° C i 10 min.
  7. Fjern alle PBS og resuspender pellet i 500 mL av iskald RNA lysisbuffer.
  8. Overfør cellesuspensjonen til et 2 ml mikrosentrifugerør.
  9. Pipetter opp og ned for å lysere cellene og inkuberes på is i 10 minutter med leilighetsvis risting.
  10. Sentrifuger ved 2000 x g ved 4 ° C i 5 min for å pelletere cellekjerner.
  11. Overfør supernatanten til et nytt 2 ml mikrosentrifugerør.
  12. Sentrifuger ved 17000 x g ved 4 ° C i 5 min for å pelletere celleavfallet.
  13. Overfør supernatanten til et nytt 2 ml mikrorøret og bruke 2 ul for å måleoptisk tetthet ved 260 nm (bruk lysisbuffer som blank).
  14. Fjern 50 ul (10% totalt) av fra hver prøve for analyse av totalt RNA. MERK Lysate kan lagres ved -80 ° C inntil nødvendig.
  15. Forsiktig laste like A260 enheter på hver sukrosegradienter (minst 10 OD, optimale 25 OD, i et maksimalt volum på 500 mL;. Fortynne konsentrert lysat med ekstra lysisbuffer hvis nødvendig).
  16. Sikrer gradienter er innen 0,1 g av hverandre forut for ultrasentrifugering.
  17. Sentrifuger gradienter på 39.000 rpm (260 343 xg) i 1,5 timer ved 4 ° C.
  18. Under spindown holde rotorbremsen på og slå den av under retardasjon når den når 1000 rpm.
    MERK: Dette trinnet minimerer forstyrrelser av gradienter forårsaket av brå endringer i akselerasjon som børstehoder kontakt rotoren under bremsing.

4. Gradient Fraksjone System Instrument Set-up.

  1. Sett opp instrumentet og tomme de spectrophotometer med vann som følger:
    1. Slå på komponentene og la lampen å varme opp i minst 15 min.
    2. Sørg fraksjonskollektor er satt til "polysome" -metoden (trykk mappeikonet to ganger; retur to ganger for å gå tilbake til startskjermen).
    3. Sørg for at ventilen på fraksjonssamleren er satt til avfall (pil som peker til papirkurv-ikonet). Plasser en 250 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende destillert vann under avfalls-røret.
    4. Velg følgende innstillinger på kurveopptegner: Set Følsomhet ringe til 'SET LAMP og optikk'; satt Noise filter bryteren til '1.5'; satt Peak separator hjulet til 'OFF'; satt Chart hurtigvalg til '30 cm / t "(5 cm / 10 min); satt Baseline Juster dial (på toppen av spektrofotometer enhet) til "MAX ÅPEN '.
      MERK: Valgfritt: En digital opptaker programvare kan brukes i stedet for punktskriver. På datamaskinen, klikker du på "Start". Et oppkjøp åpnes: Under the Options-menyen, fjern krysset Pause grafikk. Under skalering, sette graf grenser til -10 og 100 (kan endres on-the-fly under kjøring). Klikk på Lagre-knappen for å opprette en ny fil og spille inn rømmen.
    5. Plasser sprøyten og fat i pumpen og skru på plass (bruk gitt skruer og umbrakonøkkel).
      MERK: Ikke stram.
    6. Fyll sprøyten med Chase Løsning ved hjelp av '' REV '' kommando RAPID hastighet. Plasser pumpen i oppreist stilling og jage luft gjennom røret ved hjelp av '' FORWARD '' kommando. Bruk bare RAPID for denne funksjonen og vasker.
    7. Installer en ultrasentrifugerør fylt med RNase-fritt vann.
    8. Pierce ultrasentrifugerør med kanylen til de to svarte flekker er synlige (dispenserhullet ligger mellom disse to merkene) og begynne sprøytepumpe på '' Manual '' på 6,0 ml / min.
    9. Når vannet passerer gjennom strømningscellen (c nårhase løsning fyller 1/3 av røret), bytter hastighet til variable og satt til 1,0 ml / min.
    10. Med en strømningshastighet på 1,0 ml / min, justere Baseline Juster rattet på spektrofotometer til spenningen på diagrammet er på null (+/- 0,5 enheter).
      MERK: Følg vann exit fra avfallsrøret i erlenmeyerkolben.
    11. Still inn ønsket følsomhet til "0,5" eller "1.0" AU.
      MERK: 1,0 AU fungerer best for 10 OD-enheter i en 10 ml gradient. Hvis OD er ​​lavere enn 10, '0,5' følsomhet kan brukes til å forbedre signal.
    12. Skyv Auto Baseline knappen og juster baseline innstillingen til merket på kartet opptaker 10% ved å dreie Recorder offset dial (valgfritt hvis du bruker digital opptaker).
    13. Når en stabil baseline er oppnådd, slår pumpebryteren til "OFF" og Chart Speed ​​dial til 60 cm / time hvis du bruker analog diagram opptaker eller 'OFF' hvis du bruker digital opptaker.
    14. Gjenopprette Chase Solution ved å bytte pumpe til "REV 'posisjon (om nødvendig kan man øke oljemengden tilbake til 6,0 ml / min ... IKKE BRUK RAPID) til den når det første merket på piercing kanyle.
    15. Fjern sentrifugerør og jage eventuelle luftbobler i kanylen ved å kjøre en liten bit av Chase Solution gjennom den. Tørk av piercing scenen rent.
      MERK: Noen gjenværende vann kan lekke fra strømningscellen.

5. Gradient Fraksjone og innsamling av prøver.

  1. Installer og pierce sentrifugerøret inneholder sukrose gradient.
  2. Plasser elleve 2 ml mikrosentrifugerør i fraksjonssamleren skuffen stillinger 1-11 slik at hettene ikke stikker oppover. Erstatt '' tube # 1 '' for nå med en '' avfall tube '' for å samle opp eventuell væske igjen i solfangeren slangen.
  3. Sett pumpekontrollhjulet til "Manual" og strømningsrate på sprøytepumpen til '6,0 ml / min' Trykker du på "Spill" -ikonet på fraksjonssamleren. Så snart armen når den første tube, trykk på '' pause '' knappen (dette vil posisjonere armen og åpner brøkdel-utleveringsventil).
  4. Start pumpen ved hjelp av '' FORWARD '' kommando og overvåke Chart opptaker penn. Når det begynner å avbøye oppover (som indikerer at prøven passerer gjennom strømningscellen i spektrofotometeret), raskt å erstatte '' avfallsrøret '' med '' tube # 1 ''.
  5. Når den første dråpe er samlet inn, raskt bytte kommandoer til 'Remote start / stopp', '' Variabel (1,0 ml / min) '' og trykk '' Play '' ikonet.
    MERK: Pumpen blir nå kontrollert av fraksjonssamleren grensesnitt og 1 ml fraksjoner blir oppsamlet hvert minutt.
  6. Fra dette punktet, vil A260 avlesninger vises på den digitale opptakeren grensesnittet (eller analog diagrammet recorder). Pass på at '' Record '' knappen på programvaren trykkes!
  7. Etter den blå Chase Solution entrer oppsamlingsrøret eller det siste røret (vanligvis tube 11), trykker du på "Stopp" -ikonet.
    MERK: Utmatningsventilen bør bytte til avfallet ventilen.
  8. Hold fraksjoner på is inntil alle graderinger har blitt fraksjonert. På slutten av dagen fraksjoner kan lagres ved -80 ° C før protein eller RNA-isolering. Hvis det er nødvendig protein og RNA-analyse, splitte hver fraksjon i halvparten (500 mL hver for protein og RNA-analyse).

6. Vask

MERK: (dette er et valgfritt trinn som skal utføres bare hvis flere gradienter skal samles).

  1. Senk avfallsrøret inn i Erlenmeyer-kolbe som inneholdt ~ 50 ml ultrarent vann og reversere pumpen ved hjelp av en 6 ml / min strømningshastighet.
  2. Stopp pumpen når Chase Solution når den første mark on piercing kanyle.
  3. Fjern sentrifugerøret, jage eventuell luft ut av kanylen og rengjør piercing trinn.
    MERK: Noen gjenværende vann kan lekke fra strømningscellen.
  4. Gjenta fraksjone prosedyren fra punkt 5.1.

7. Endelig Rydd opp.

  1. Frakoble pumpeslangen fra bunnen av gjennomtrengeren og pumpen Chase løsning i et 50 mL sentrifugerør ved hjelp av den raske strømningsinnstillingen. Oppbevar Chase løsning ved 4 ° C som det kan brukes om igjen.
  2. Koble pumpeslangen til en 3-veis rørsystem og lukke ventilen som fører til sprøyten. Koble et rør til en 50 ml sprøyte fylt med destillert vann og det andre rør til bunnen av gjennomtrengeren.
  3. Installer ultrasentrifugerør brukes for blanking trinnet og passere minst 50 ml destillert vann gjennom spektrofotometer og samling rør (bryteren til samlingen menyen på grensesnittet ved å klikke på '' Start / Pause '' ikon).
  4. Fjern tube, sprøyte (bruk unbrakonøkkel for å fjerne skruer) og alle andre flyttbare komponenter og vask grundig med varmt vann fra springen og skyll med ultrarent vann.
    MERK: Vær spesielt forsiktig når du vasker stempelet, fat, tubing og piercing kanyle.
    MERK: Håndter glassprøyten med forsiktighet! Oppbevar alle komponenter fra støv.
  5. Tørk bunnen av strømningscelle med en myk tissue fuktet med destillert vann. Tørk av fraksjonskollektor skuffen og eventuelle andre områder hvor sukrose har rent over.

8. Isolering av RNA fra Sukrose Brøker.

  1. Forbered 50 ul proteinase K-løsning for hver 1 ml sukrose fraksjon (37,5 ul 10% SDS, 7,5 pl 0,5 M EDTA, 1 ul Glycoblue, 4 ul av 20 mg / ml proteinase K).
  2. I 2 ml flatbunnet rør, inkubere 1 ml sukrose fraksjon med 50 ul proteinase K-løsning ved 55 ° C1 time (hvis du bruker 500 mikroliter fraksjoner justere volumet av proteinase K-løsning tilsvarende).
  3. Legg et likt volum av fenol: kloroform: isoamylalkohol (125: 24: 1, fortrinnsvis sure (pH 4.5) for å minimalisere kontaminering DNA) til sukrose fraksjoner.
    MERK: Legg en ekstra 200 mL av kloroform til fraksjonene 7-10 fordi de er tyngre og faser kunne bli invertert.
    MERK: fenol / kloroform kan forårsake brannskader på kontakt og innånding. Wear labfrakk, vernebriller, og bruk en fumehood.
  4. Vortex ~ 30 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 5 min ved romtemperatur.
  5. Fjern ~ 80-90% av vannfasen (ikke berører inter som kan inneholde genomisk DNA) og plasser i nytt rør.
  6. Legg et like stort volum av kloroform og gjenta trinn 8.4.
  7. Fjern vandige fasen være forsiktig for å unngå inter.
  8. Legg 01:10 volum av 3 M natriumacetat, pH 5,2 (alternativt 5 M ammoniumacetat kan benyttes).
  9. Legg 1.5 volumer av kjølt, absolute etanol og vortex i 15 sek.
  10. Fremskynde natten ved -20 ° C (eller 1 time ved -80 ° C hvis du er i et rush).
    MERK: Prøvene kan stå ved -20 ° C i lengre tid hvis nødvendig.
  11. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 30 min ved 4 ° C.
  12. Vask pelleten med 1 ml kjølt RNase-fritt 70% etanol.
  13. Air tørke pelleten og resuspender i 20 ul RNase-fritt vann.
  14. Kvantifisering av total RNA ved spektrofotometri for å sikre tilfredsstillende utbytte og renhet (basert på A260 / 280-forhold) og fortsette til standard RT-qPCR-analyse 14 ved anvendelse av like volumer av hver fraksjon og PCR-primere som er spesifikke for mRNA (er) av interesse.

9. Isolering av Proteiner fra Sukrose Brøker.

  1. I tillegg til RNA, proteiner kan bli isolert og identifisert i de enkelte fraksjoner polysome også. Bruk en av mange gode protokoller tilgjengelig for protein isolasjon, for eksempel 18 år.

Representative Results

Vi har nylig beskrevet en ny rolle for tumor suppressor PDCD4 som en selektiv oversettelse hemmer av IRES-husing mRNA som koder apoptotiske hemmere XIAP og BCL-XL 12. Polysome profilering var en viktig teknikk for å demonstrere den spesifikke involvering av PDCD4 i IRES-mediert oversettelse. HEK293-celler ble transient transfektert for å utarme endogene nivåer av PDCD4 (figur 1A), og deretter underkastet polysome profilanalyse. Vi observerte at å redusere nivåene av PDCD4 ikke svekke den globale mobil oversettelse, som bedømmes av mangel på endringer i polysome profil når man sammenligner siCTRL og siPDCD4 behandlede celler (figur 1B). Tilsvarende, polysome fordeling av ikke-IRES variant av XIAP 19 var uendret mellom behandlede og ubehandlede celler (figur 1C). I motsetning til dette, polysome fordelingen av de to IRES-husing mRNAer, XIAP og Bcl-xL, ble signifikant endret. I fravær av PDCD4 fordelingen av disse to mRNA'ene blir forskjøvet inn i tung ribopolysomes (figur 1D, E). Siden dette ikke er ledsaget av endringer i steady-state nivåer av XIAP og Bcl-xL mRNA (figur 1F) Disse resultatene viser forbedret oversettelse av XIAP og BCL-XL i celler med reduserte PDCD4 nivåer, noe som ble ytterligere bekreftet ved Western blotting (Figur 1G).

Figur 1
Fig. 1: Polysome profilering identifiserer PDCD4 som selektiv hemmer av XIAP og Bcl-xL oversettelses (A) HEK293-celler ble behandlet med PDCD4 siRNA eller kontroll (Ctrl), ikke-målsøkende siRNA, lysert og utsatt for Western blot-analyse med anti-PDCD4 og anti-Nucleolin antistoffer for å kontrollere omfanget av PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 ble slått ned som i (A) ogcellelysater ble utsatt for polysome profilering. Representant polysome profilen vises i den øverste panel; fordeling av XIAP ikke-IRES (C), er Bcl-xL (D), og XIAP IRES (E) mRNA i forhold til det av GAPDH vist som prosent av total mRNA (% mRNA) i hver fraksjon. (F) Steady -State mRNA-nivåer ble målt ved hjelp av RT-qPCR i PDCD4 siRNA eller kontroll (Ctrl) siRNA behandlede celler. (G) Lysatene fra (A) ble også utsatt for Western blot-analyse med anti-XIAP, anti-Bcl-xL, og anti-Nucleolin antistoffer. (NB. Dataene som presenteres i figur 1 ble opprinnelig utgitt i 12) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Polysomal profilering er en kraftfull teknikk som gjør det mulig for kvantifisering av staten oversettelse av spesifikke transkripsjoner under ulike behandlingsforhold. Det er en veldig enkel teknikk i prinsippet, men det krever flere trinn for gjennomføring, hvorav noen er kritiske for å produsere gode polysome profiler. Disse nøkkel trinnene er: 1) med RNase-frie kjemikalier og plasticware, 2) å utarbeide gode sukrosegradienter (etter vår erfaring en 10-50% sukrosegradienter fungerer best for effektivt å løse 40 / 60S subenheter og mRNA med innbundne ribosomer), og 3 ) ved hjelp av celler som er eksponentielt voksende og ikke mer enn 80% sammenflytende for å fange de høyeste tallene for oversettelse. Dette sistnevnte trinn bør tas i betraktning når man gjør lange cellen behandlinger, slik som genet knockdown eller overekspresjon, slik at mengden av cellene til platen, vil være en funksjon av hvor mye cellene vil bli sammenflytende ved endepunkt.

I resultatene presented her, polysome profilanalyse var et viktig redskap for å vurdere PDCD4 rolle i oversettelsen regulering av IRES-husing mRNAs XIAP og BCL-XL 12. Det faktum at vi ikke observere noen endring i de generelle polysome profiler på PDCD4 knock-down (figur 1B) mulig for oss å konkludere med at PDCD4 ikke svekke den globale mobil oversettelse under betingelsene for forsøket. Vi benyttet ved RT qPCR-analyse for å bestemme fordelingen av XIAP og Bcl-xL mRNA i celler behandlet med PDCD4 eller kontroll sirnas. qPCR er en metode for valg for å analysere polysome profiler, i motsetning til standard RT-PCR eller Northern blotting, fordi den muliggjør en kvantitativ snarere enn semi-kvantitativ analyse av mRNA-fordeling og for påvisning av subtile endringer i effektivitet translatorisk mellom behandlingene. Ved hjelp av denne teknikken, var vi i stand til å vise at fordelingen av de XIAP og BCL-XL mRNA (uttrykt som en prosent av total target mRNA over gradient) ble signifikant forskjøvet inn i tung polyribosomes (mRNA med et stort antall av ribosomer forbundet med dem) etter PDCD4 knock-down (figur 1D, E), og således indikerer en økning i mRNA translasjon av disse. Dette ble ytterligere bekreftet ved en økning i XIAP og BCL-XL protein nivåer, men ikke i sine steady-state RNA nivåer (figur 1F, G). Viktigere er det polysome fordelingen av de ikke-IRES variant av XIAP var uforandret mellom behandlede og ubehandlede celler (figur 1C). Alternativt kan translasjonelle effektivitet bli presentert som et forhold mellom mRNA-innholdet i polysomes (vanligvis fraksjoner 5 til 10) som funksjon av monosomes (vanligvis fraksjoner 2 til 4) 14.

Bruk av kontroller i hele protokollen er viktig å validere noen polysome profilering resultat, som topper observert fra avlesninger ved 254 nm kan ikke på egen hånd tilskrives ribosomalt RNA (vaskemiddels, som for eksempel Triton X-100 sterkt absorberer i dette området av spekteret, og kan utydelig 40 / 60S topper ved toppen av gradienten). Blanke gradienter uten lysat og / eller med lysat buffer må kjøres for å bestemme den relative bidraget av buffere til absorbans ved 254 nm. Gjenstands høyere ordens strukturer kan også føre til feilaktige tolkninger av polysomes der det er faktisk ingen (f.eks "pseudo-polysomes" 20). Sekvestrering av magnesium (anvendt gjennom hele fremgangsmåten for å stabilisere 80S ribosomene) med det divalente kation-chelator EDTA tilsatt til lysatene, og til gradient-buffer (20 mM i 15 min) vil føre til separasjon av ribosomet i dens komponent liten (40S) og store (60S ) subenheter. Hvis således absorbanstoppene registrert ved 260 nm er faktisk polysomes, vil kollapse EDTA behandling profilen, slik at en enkelt maksimum vil bli observert i nærheten av toppen av gradienten som tilsvarer frigjøre mRNA og ribosomale enheter (data ikke vist). Sammenfallendemed EDTA-indusert kollaps av profilen, alle de konkrete mål analysert ved qPCR skal nå bli funnet på toppen av graderingen.

Antallet ribosomer forbundet med en mRNA er ikke alltid en effektiv indikator på hvordan den aktuelle mRNA blir oversatt. Faktisk, er det spesifikke sammenhenger der aktiv oversettelse på polysomes blir fastlåste 21,22 som leseren bør være klar over. Bestemme hvorvidt eller ikke-transkripter er aktivt engasjert med oversettelsen maskiner kan gjøres ved a) behandling av prøven med puromycin, som i motsetning til EDTA, som forårsaker "run-off" av ribosomer som er aktivt over en translocating mRNA, eller b) behandling av prøven med homoharringtonine som hemmer translokasjon av bare den første ribosom på startkodonet, igjen forårsaker "run-off" av noen nedstrøms translocating ribosomer.

Bruken av styre transkripter for qPCR-analyse er også kritisk. Den selecsjon av vitnemål som ikke er påvirket av ulike behandlingsforhold som noen housekeeping gener (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNA (18S, RPL13A) eller i dette tilfellet ikke-IRES variant av XIAP IRES, er viktig i verifisere om behandlingen effekt på oversettelsen er bestemt eller generalisert. Disse kontroll transkripter kan brukes til å normalisere fordelingen av de analyserte mRNAer slik det ble gjort her (XIAP og Bcl-xL mRNA ble normalisert til GAPDH mRNA og uttrykt som en prosentandel av den totale mRNA-innhold representeres av summen av mRNA-innholdet i hver fraksjon ) eller alternativt, kan mål- og kontroll mRNA uttrykkes som absolutte verdier og vist separat. qPCR analyse av inngangs lysater (vanligvis 10% av totalvolumet) er et nytt skritt som vil kontrollere for distribusjon av spesifikke mRNA. Ideelt sett bør mRNA-innholdet av et bestemt transkript i inngangs lysat kunne sammenlignes med summen av mRNA-innholdet i alle 10 fraksjoner som ble analysert. Endelig, Et valgfritt trinn for å kontrollere for fenol: kloroform-ekstraksjon trinn er å pigge hver polysome fraksjon med en in vitro-transkribert mRNA reporter (for eksempel CAT, kloramfenikol acetyl transferase) som deretter vil bli kvantifisert ved qPCR og kan også bli brukt til å normalisere Data 14.

Som med hvilken som helst teknikk, presenterer polysome profilering noen begrensninger. Det faktum at vanligvis et minimum på 10 fraksjoner (mer subtile endringer i oversettelses effektivitet kan kreve 20 eller mer) må samles for å ha fine fordelinger polysome gjør dette trinnet begrensende, i den forstand at bare et maksimum på 4 prøver kan bli analysert om gangen for å være ubehagelig å håndtere RNA ekstraksjon og qPCR analyse av 40 prøver og 4 inndatakontrollene samtidig. Utvalgsstørrelsen kan enkelt legge opp med hvor mange transkripsjoner er å bli analysert og hvor mange qPCR replikerer å gjøre, og dette kan være kostbart. En annen begrensning av en qPCR-baserte polysomal en profileringnalysis er at det kan kun gjøres på en kandidat basert tilnærming (hvor de transkriptene som skal analyseres er kjent på forhånd) og kan ikke bli brukt for genom-omfattende analyse av oversettelse. Men i begynnelsen av det 21. århundre, begynte etterforskere å avhøre deres polysomal RNA på et genomisk nivå ved hjelp av DNA-mikromatriser 15 og mer nylig med neste generasjons sekvense 16,17. I dette kraftfull tilnærming, er polysomal profilering utført som beskrevet i denne protokollen, bortsett fra at i stedet for å utføre qPCR analyse av enkeltfraksjoner, monosomes fraksjoner (vanligvis fraksjon 2-4) og polysomes fraksjoner (vanligvis fraksjoner) kan grupperes sammen og variasjoner i den globale oversettelse analysert ved DNA microarray eller hel-genom RNA sekvensering. Derav med denne tilnærmingen, er det mulig å vurdere alle mRNA hvis distribusjon skift fra polysomes til monosomes (reduksjon i oversettelse) eller omvendt (økning i oversettelse) ved en bestemt godbitment. Validering og kvantifisering av spesifikke mRNA-polysomes fordeling kan da gjøres ved qPCR. En enda mer kraftfull bruk av polysomal profilering prinsippet er ribosom profilering. Ytterligere high throughput forlengelse av denne teknikken ble nylig rapportert at tillater samtidig overvåking av hundrevis av polysome fraksjoner 23. Dette gir en klar fordel når sondering translasjonsforskning effektiviteten av muterte samlinger eller i en storstilt RNAi skjermer. Ribosom profilering er en teknikk som utnytter neste generasjons sekvensering for å kartlegge RNA fragmenter beskyttet av ribosomer (ribosom fotavtrykk) engasjert i proteinsyntesen 24,25. I denne teknikken, kan ribosom-translokasjon inhiberes med cykloheksimid (reversibel) eller emetine (irreversibel) etterfulgt av cellelyse og RNase-fordøyelse til å gi en populasjon av ribosom overføringene. Ribosomer er anriket, total-RNA isoleres, og forurenser ribosomal og mitokondrielle ribosomalt RNA er fjernet.RNA fotavtrykk på ca 26-28 nukleotider er isolert, revers transkribert, omgjort til et cDNA bibliotek og sekvensert 26. I motsetning til standard polysome profilering, denne tilnærmingen ikke bare identifiserer bestemte mRNAer som er translatorisk regulert, men også gir mRNA-spesifikk informasjon ved kodon oppløsning, for eksempel den nøyaktige stilling og tettheten av ribosomer langs et bestemt transkript. Dette er særlig aktuelt for mRNA med spesielle moduser av oversettelse som IRES-husing mRNA, som det kunne gi mer informasjon om hvor på karakterutskriften ribosom-rekruttering skjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  3. Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
  4. Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
  5. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  6. McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
  7. Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
  8. Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
  9. Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
  10. Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
  11. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  12. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  13. Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
  14. Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
  15. Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
  16. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
  17. Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
  18. Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
  19. Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
  20. Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
  21. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  22. Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
  23. Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
  24. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).

Tags

Cellular Biology cellulært stress oversettelse initiering intern ribosom oppføring nettsted polysome RT-qPCR gradient
Vurdering av Selektiv mRNA Oversettelse i pattedyrceller ved Polysome Profiling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik,… More

Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter