레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
우리는 먼저 형광 표지 된, 비 – 부착 인간 또는 뮤린 효과기 면역 세포의 운동성을 측정하기 위해, 세포 외 기질 단백질에 부착 된 종양 세포의 반경 방향 이동을 측정하는 것으로보고, 방사형 단층 세포 이동 분석법 신규 적응을보고한다. 이 기술은 스테인리스 매니 폴드 10 웰 테플론 슬라이드 국소 적 융합 성 종양 세포 단층 또는 세포 외 기질 단백질로 제조 중 웰로 미부착 된 T 세포를 증착하기 위해 사용한다. 광 및 / 또는 다 채널 형광 현미경은 시간이 지남에 이펙터 세포의 이동 및 동작을 추적하는 데 사용된다. 형광 염료 및 / 또는 형광 유전자에 대한 코드가 차등 이미징 세포 유형에 라벨을 사용하는 바이러스 벡터. 이 방법은 슬라이드 챔버, 한천 또는 트랜스 웰 플레이트를 이용하여 수평 또는 수직 마이그레이션 / 침략을 추적 체외 분석에서 비슷한 유형 구별된다. 분석은 상세한 영상 데이터가 ㄱ 할 수 있습니다특정 형광 마커에 의해 구별 다른 종류의 세포로 수집 된 전자; 세포의 경우에도 특정 하위 집단 (즉, nontransduced / 형질)을 모니터링 할 수 있습니다. 표면 강도 형광 플롯 이주 셀 타입에 대응하는 특정 형광 채널을 이용하여 생성된다. 이것은 특정 시간에 비 부착 면역 세포 이동의 더 나은 시각화 할 수 있습니다. 그것은뿐만 아니라, 세포를 대상으로 같은 세포 독성 또는 이펙터에서 바이러스 벡터의 전송과 같은 다른 이펙터 세포 기능의 증거를 수집 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 연구자들이 다양한 유형의 미시적 부착 세포 차분 적 표지 된, 비 – 부착의 세포 간 상호 작용을 기록 할 수있다. 이러한 정보는 기능의 시각적 증거가 암 치료를위한 이들의 사용 전에 종양 표적 세포에 요구되는 생물학적 활성 또는 조작 면역 세포 유형의 평가에 특히 적합 할 수있다.
Introduction
방사형 단층 세포 이동 분석은 원래 세포 외 기질 (ECM) 단백질 5-7 또는 피브로넥틴 또는 라미닌 1,2- 개별 ECM 성분으로 코팅 된 슬라이드 부착 성 종양 세포의 1-4 침윤성 특성을 측정하기 위해 개발되었다. 기술은 스테인레스 스틸 셀 침강 매니 폴드 (CSM)을 사용하여 웰의 중심에 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 시딩 관여. 침전 후, 종양 세포는 수평 운동의 속도를 설정하는 데 사용 된 시간과 웰 위에 초기 세포 집단의 직경 변화의 하단에 부착된다. 방사형 단층 세포 이동 분석은 세포의 체외 철새 능력을 분석하는 트랜스 웰 플레이트를 채용 기존의 방법에 비해 시각적 인 장점을 제공; 이러한 분석은 촬상 8 비 이바지. 뿐만 아니라, 또한 평가시기를 선택하는 자유도 다량 구비마이그레이션, 평가된다 시점들의 수에 제한이없는 연구자가 침전 후 이미지를 선택할 수있을 때에요.
이동하는 능력이 특히 그들은 바이러스 벡터에 대한 전달 비히클로서 사용될 수있다 면역 또는 여기서의 영역에서, 비 – 부착 세포에 중요한 기능을하기 때문에, 우리는 미부착 된 세포의 이동을 평가하기 CSM의 사용을 채택 종양 세포 단층상의 종류, ECM 단백질 이외에. 현미경, 또는 개별 ECM 구성 요소에 종양에서 고립 복잡한 ECM에, 가능한 종양 세포 단일 층에 비 부착 세포의 이동을 시각화의 추가 혜택이 분석은 다양한 있습니다. 하나의 세포 외 단백질로 코팅 우물을 사용하는 분석은 정확하게 세포가 생체 내에서를 통해 마이그레이션 것 ECM 조직 기판 또는 종양을 반영하지 않습니다.
여기서 우리는 주요 histocomp 민감 alloreactive 세포 독성 T 림프구 (alloCTL)를 사용우리의 대표적인 비 – 부착 세포 유형으로, 단방향 혼합 림프구 종양 세포 반응 (MLTR) 또는 혼합 림프구 반응 (MLR)을 사용하여 구 atibility 복합체 (MHC) 단백질. 우리는 모두 인간과 쥐 기원의 세포를 시험했다. 마이그레이션 종양 단층을 측정 한 결과, 고용 종양 세포가 부분적으로 관련 대상 MHC 분자의 전체 세트와 이펙터, 또는 완전히 관련 목표를 감작하는 데 사용되는 세포 집단에서 발견 동일한 MHC 단백질의 일부를 표시되었는지 이펙터를 향해 민감했다. 일부 실험에서, 우리는 이펙터와 대상 세포를 구분하는 형광 CellTracker 레드 CMPTX 또는 세포 증식 염료 eFluor (670)을 사용했다. 또한 세포를 시각화하는 추가적인 방법으로 형광 단백질 바이러스 벡터로 형질 도입 인코딩을 사용했다. 특정 분석을 위해, 우리는 에메랄드 그린 (EMD) 형광 단백질 (10, 11)을 코딩하는 레트로 바이러스 복제 벡터 (RRV)로 alloCTL를 형질 도입; OTH에 대한ERS 종양 세포 mStrawberry 코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입 하였다.
alloCTL 종양 세포 단층에서 수확 종양 세포 단층 또는 ECM 하나의 중심으로 매니 폴드의 채널을 통해 접종 하였다. 점착성 및 비 점착성 세포 상호 작용에 의해 빛 및 / 또는 시간에 따른 형광 현미경에 의해 가시화 하였다. 고전력 파편과 핵 저전력 종양 세포 단일 층 붕괴, 또는 종양 세포는 각각 분해 및 아폽토시스에 의한 세포 손상의 지표였다. 우리는 디지털 단층 배양 위에 미부착 된 형광 T 세포의 이동을 나타내는 표면 형광 세기 맵을 생성. 우리는 또한 세포 독성이 포개어 미부착 alloCTL의 클러스터 형성 후 부착 신경 교종 세포 단층에 생기게 언급. 뿐만 아니라, 신경 교종 단층에 alloCTL에서 RRV-EMD의 수평 전달이 관찰되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 세포 현탁액 중의 종양 세포는 테프론 마스크 슬라이드의 웰에 피펫 팅 하였다. 세포가 접착 가능하고 가습 된 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기 (도 1a)에 단분자층을 형성 하였다. 단일 층에서 파생 설립 된 단일 층 또는 ECM 단백질은 이러한 분석 (그림 1B) 수확 할 수있다. EMD를 코딩하는 벡터로 중요한 형광 염료로 표지 또는 형질 이펙터 T 림프구 웰을 사용 CSM의 중심으?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI 허가 번호 UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, 그리고 조안 S. 홈즈 기념 연구 기금에 의해 부분적으로 지원됩니다. MJH와 GCO는 UCLA에서 조안 S. 홈즈 기념 박사후 원정대에서 지원 받았다. CSM 장치는 창조적 인 과학적인 방법에서 얻은 : www.creative-sci.com. 렌티 바이러스 벡터는 CURE / P30의 DK041301 지원하는 UCLA 벡터 코어에서 받았습니다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
Riferimenti
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