Радиальная Мобильность и цитотоксическую функцию ретровирусных Репликация Векторный Трансдуцированные неприлипшие Alloresponsive Т-лимфоцитов
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Мы сообщаем о новой адаптации радиального монослойной клеточной миграции анализа, впервые сообщили для измерения радиального миграцию адгезивных клеток опухоли на белки внеклеточного матрикса, для измерения моторику флуоресцентно меченных клеток иммунной системы, не соблюдают человека или мышиный эффекторных. Этот метод использует коллектор из нержавеющей стали и 10-а тефлон слайд централизовано хранение неадгезированных Т-клеток в лунки составляться либо сливающихся монослоев опухолевых клеток или белков внеклеточного матрикса. Свет и / или многоканального флуоресцентной микроскопии используется, чтобы отслеживать движение и поведение эффекторных клеток в течение долгого времени. Флуоресцентные красители и / или вирусные векторы, которые кодируют для люминесцентных трансгенов, используемые для по-разному маркировать типы клеток, для работы с изображениями. Этот метод отличается от аналогичного типа в анализах пробирке, которые отслеживают горизонтальную или вертикальную миграцию / вторжение с использованием камеры слайдов, агар или Transwell пластин. Анализ позволяет подробные данные отображения бе собирали с различными типами клеток, отличающихся от конкретных флуоресцентных маркеров; даже конкретные субпопуляции клеток (то есть, трансдуцировали / nontransduced) можно контролировать. Поверхностные интенсивность флуоресценции участки формируются с использованием конкретных каналов флуоресценции, которые соответствуют типу Миграция клеток. Это позволяет лучше визуализировать неадгезивные мобильности иммунных клеток в определенное время. Можно собирать доказательства других эффекторных функций клеток, таких как цитотоксичности или передачи вирусных векторов из эффектора к клеткам-мишеням, а также. Таким образом, метод позволяет исследователям микроскопически документ от клетки к клетке взаимодействия дифференциально-меченого неприлипшие с прикрепленных клеток различных типов. Такая информация может быть особенно актуально при оценке биологически-манипулировать или активированных типов иммунных клеток, где наглядное доказательство функциональности желательно с опухолевых клеток-мишеней перед их использованием для лечения рака.
Introduction
Радиальная однослойная миграция клеток для анализа был первоначально разработан для измерения инфильтративные свойства адгезивных клеток опухоли 1-4 на предметные стекла, покрытые внеклеточного матрикса (ECM) белков 5-7 или отдельных компонентов ECM, таких как фибронектин или ламинин 1,2. Методика участие посева суспензии отдельных клеток опухолевых клеток в центре скважин с использованием клеток седиментации коллектор из нержавеющей стали (CSM). После седиментации, опухолевые клетки будут прилипать к нижней части скважины и изменению диаметра исходной клеточной популяции с течением времени был использован, чтобы установить скорость горизонтальной подвижности. Радиальная однослойная миграция клеток для анализа обеспечили визуальную преимущество перед другими существующими методами, которые использовали Transwell пластины для анализа в пробирке мигрирующих возможности клеток; Эти анализы не являются благоприятной для визуализации 8. Кроме того, он также предоставил большое количество свободы в выборе временной точкех годов, когда миграция оценивается, без ограничения по количеству временные интервалы исследователь может выбрать изображения после осаждения.
Поскольку способность к миграции является важным функциональность для не-адгезивные клетки, особенно в области иммунотерапии или где они могут быть использованы в качестве средств доставки вирусных векторов, мы адаптировали использование CSM для оценки миграции неприлипающими клетки Типы на опухолевых клеточных монослоев, в дополнение к белкам ЕСМ. Дополнительным преимуществом микроскопом визуализации миграцию без прикрепленных клеток на жизнеспособных опухолевых клеток монослоев, на комплексном ECM, выделенной из опухолей, или на отдельные компоненты ECM делает этот анализ универсальным. Анализы, которые используют лунки, покрытые с одной внеклеточной белка не отражают точно ECM тканей субстрата или опухоль клетки будут мигрировать через в естественных условиях.
Здесь мы использовали аллореактивными цитотоксические T-лимфоциты (alloCTL), с повышенной чувствительностью к главной histocompatibility комплекс (МНС) белки, использующие одну сторону опухоли смешанной культуры лимфоцитов клеток реакции (MLTR) или смешанные реакции лимфоцитов (MLR) 9, как наш представитель неприлипающими типа клеток. Мы протестировали клетки человека, так и мышиный происхождения. При миграции измеряли на опухолевых монослоев, опухолевые клетки, используемые были либо частично соответствующих целей, показывая некоторые из тех же белков МНС, найденных на клеточной популяции, используемого для сенсибилизации эффекторы или полностью соответствующие цели, с полным набором молекул МНС, что эффекторы были осведомлены навстречу. В некоторых экспериментах мы использовали флуоресцентный CellTracker Red CMPTX или пролиферации клеток красителя eFluor 670 различать эффекторных и клеток-мишеней. Мы также использовали трансдукции кодирования вирусных векторов для флуоресцентных белков в качестве дополнительного способа визуализации клеток. Для некоторых анализов, мы трансдуцировали alloCTL с ретровирусных векторов реплицирующихся (макака), кодирующих изумрудно-зеленый (EMD) флуоресцентного белка 10,11; для дрERS, опухолевые клетки трансдуцированных лентивирусов векторов, кодирующих mStrawberry.
AlloCTL высевают через канал коллектора в центре либо монослоев опухолевых клеток или ECM, собранных с опухолевых клеток монослоя. Адгезивные и не прилипшие межклеточных взаимодействий были визуализированы с помощью света и / или с помощью флуоресцентной микроскопии с течением времени. Нарушения в опухолевых клеток монослоя на малой мощности, или опухолевые клетки с фрагментированными ядрами при высокой мощности были показатели повреждения клеток в результате лизиса и апоптоза, соответственно. Мы цифровой создал интенсивности поверхностного дневного карты, показывающие миграции неприлипающих флуоресцирующий Т-клеток над однослойных культур. Мы также отметили, цитотоксичность гендерная проблематика, клейкой монослоя глиомы клеток после формирования кластерной накладным неадгезированных alloCTL. Кроме того, было отмечено горизонтальной трансдукция RRV-EMD от alloCTL к глиомы монослоя.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опухолевые клетки в суспензии отдельных клеток пипеткой в лунки тефлоном маскируется слайда. Клетки дают возможность прилипать, а затем формируется монослоев в увлажненной 5% CO 2, 37 ° С инкубатор (фиг.1А). Установленные монослои или ECM белки, полученные из монослоя могут…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа частично поддержана NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA аст Грант Количество UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, и Холмс исследовательского фонда Джоан С. Мемориал. MJH и ОПО получили поддержку из Джоан С. Холмс Мемориал докторантуру в Лос-Анджелесе. Устройство CSM была получена из творческих научных методов: www.creative-sci.com. Лентивирусный вектор был получен из Калифорнийского университета Векторный Core, которая поддерживается CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
Riferimenti
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. f. D. C. a. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
