Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Presentamos una adaptación de la novela del ensayo de migración celular Radial monocapa, informó por primera vez para medir la migración radial de las células tumorales adherentes en las proteínas de la matriz extracelular, para la medición de la motilidad de las células marcadas con fluorescencia, humanos no adherente o efectoras inmunes murino. Esta técnica emplea un colector de acero inoxidable y 10 pocillos deslizante de Teflon para depositar focalmente células T no adherentes en los pocillos preparadas con monocapas confluentes de células tumorales o proteínas de la matriz extracelular. Microscopía de fluorescencia de luz y / o multi-canal se utiliza para seguir el movimiento y comportamiento de las células efectoras con el tiempo. Los colorantes fluorescentes y / o vectores virales que codifican para transgenes fluorescentes se utilizan para etiquetar diferencialmente los tipos de células para la imagen. Este método es distinto del de tipo similar en ensayos in vitro que el seguimiento de la migración / invasión horizontal o vertical utilizando cámaras de diapositivas, agar o transwell placas. El ensayo permite que los datos detallados de imagen para Be recogido con diferentes tipos de células que se distinguen por marcadores fluorescentes específicos; incluso subpoblaciones específicas de células (es decir, transducidas / nontransduced) pueden ser monitoreados. Parcelas de superficie intensidad de fluorescencia se generan utilizando canales específicos de fluorescencia que se corresponden con el tipo de célula que migra. Esto permite una mejor visualización de la movilidad de las células inmunes no adherente en momentos específicos. Es posible reunir pruebas de otras funciones de células efectoras, tales como la citotoxicidad o la transferencia de vectores virales de efector a células diana, también. Por lo tanto, el método permite a los investigadores documentan microscópicamente-célula a célula interacciones de diferencialmente marcado con, no adherente con células adherentes de diferentes tipos. Dicha información puede ser especialmente relevante en la evaluación de tipos de células inmunes biológicamente manipuladas o activados, cuando se desea una prueba visual de la funcionalidad con las células diana tumorales antes de su uso para la terapia del cáncer.
Introduction
El ensayo de migración de células Radial monocapa se desarrolló originalmente para medir las propiedades infiltrantes de células tumorales adherentes 1-4 en portaobjetos recubiertos con matriz extracelular (ECM), las proteínas 5-7 o con componentes de ECM individuales, tales como fibronectina o laminina 1,2. La técnica involucrada sembrar una suspensión de células individuales de células tumorales en el centro de pozos utilizando un colector de células de sedimentación de acero inoxidable (CSM). Después de la sedimentación, las células tumorales se adherirá a la parte inferior del pozo y el cambio en el diámetro de la población celular inicial en el tiempo se utilizó para establecer una tasa de movilidad horizontal. El ensayo de migración de células Radial Monocapa proporciona una ventaja visual sobre otros métodos existentes que emplean transwell placas de ensayo de las capacidades migratorias in vitro de células; estos ensayos no son propicias para la imagen 8. Además, también proporciona una gran cantidad de libertad en la elección del punto de tiempos cuando se evalúa la migración, sin límite en el número de puntos de tiempo un investigador podría elegir a la imagen después de la sedimentación.
Debido a que la capacidad de migrar es una funcionalidad importante para las células no adherentes, especialmente en el área de la inmunoterapia o donde pueden ser utilizados como vehículos de administración para los vectores virales, se adaptó el uso de la CSM para evaluar la migración de células no adherentes tipos en monocapas de células tumorales, además de las proteínas de ECM. El beneficio añadido de microscópicamente la visualización de la migración de las células no adherentes en monocapas de células tumorales viables, en ECM complejo aislado del tumor, o en los componentes de ECM individuales hace que este ensayo versátil. Los ensayos que emplean pocillos recubiertos con una sola proteína extracelular no reflejan con exactitud el sustrato tejido o tumor ECM las células se migrar a través in vivo.
Aquí, utilizamos alorreactivas linfocitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a gran histocompcomplejo atibility (MHC) de proteínas utilizando reacciones unidireccional de células tumorales de linfocitos mixtos (MLTR) o reacciones de linfocitos mixtos (MLR) 9, como nuestro representante tipo de células no adherentes. Hemos probado células tanto de origen humano y murino. Cuando la migración se midió en monocapas tumorales, las células tumorales empleadas eran objetivos, ya sea parcial pertinentes, se presentan algunas de las mismas proteínas MHC se encuentran en la población de células utilizado para sensibilizar a los efectores, o metas plenamente pertinentes, con un conjunto completo de moléculas del MHC que el efectores habían sensibilizado hacia. En algunos experimentos, se utilizó CellTracker fluorescente de color rojo CMPTX o tinte proliferación celular eFluor 670 para diferenciar entre las células efectoras y diana. También utilizamos la transducción con codificación de vectores virales para proteínas fluorescentes como una forma adicional de visualizar las células. Para ciertos ensayos, transduced la alloCTL con vectores retrovirales de replicación (RRV) que codifican para el verde esmeralda (EMD) de la proteína fluorescente 10,11; para othres, las células tumorales fueron transducidas con vectores lentivirales que codifican mStrawberry.
El alloCTL se sembraron a través de un canal del colector en el centro de cualquiera de las monocapas de células tumorales o ECM cosechadas a partir de monocapas de células tumorales. Interacciones de las células adherentes y no adherentes se visualizaron por la luz y / o por microscopía de fluorescencia con el tiempo. Interrupción en la monocapa de células tumorales a baja potencia, o tumorales células con núcleos fragmentados a alta potencia fueron los indicadores de lesión celular por lisis y la apoptosis, respectivamente. Hemos creado digitalmente mapas fluorescentes intensidad superficie que muestran la migración de las células fluorescentes T no adherentes en los cultivos en monocapa. También notamos la citotoxicidad engendró a la monocapa de células de glioma adherente después de la formación de agrupaciones de la alloCTL no adherente superpuesto. Además, se observó la transducción horizontal de RRV-EMD desde el alloCTL a la monocapa de glioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células tumorales en una suspensión de células se pipetearon en los pocillos de un portaobjetos de Teflon-enmascarado. Las células se dejaron adherir y luego formaron monocapas en un humidificado 5% de CO 2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocapas establecidas o proteínas ECM derivados de la monocapa pueden ser cosechadas para estos ensayos (Figura 1B). Linfocitos T efectores marcados con colorantes fluorescentes vitales o transducidas con vectores que codifican pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyado en parte por el NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI la subvención Número UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, y el Fondo de Investigación Joan S. Holmes Memorial. MJH y GCO recibieron el apoyo de la Joan S. Holmes Memorial beca posdoctoral en la UCLA. El dispositivo CSM se obtuvo de métodos científicos creativos: www.creative-sci.com. El vector lentiviral se recibió de la UCLA Vector Core, que es apoyado por DK041301 CURE / P30.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
Riferimenti
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