تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي
Summary
We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.
Abstract
استبدال هو استراتيجية فريدة من نوعها وضعت لاستهداف أكثر فعالية البروتين البروتين التفاعلات (مثبطات مضخة البروتون). انها تهدف الى توسيع المساحة المتوفرة على الهدف المخدرات من خلال توفير منهجية محسنة لتحديد مثبطات لمثل هذه المواقع الملزمة والتي تمثل غالبية الأهداف المحتملة المخدرات. والهدف الرئيسي من هذه الورقة هو تقديم لمحة المنهجية لاستخدام وتطبيق استراتيجية استبدال الذي ينطوي على النهج الكيمياء الحسابية والاصطناعية. استبدل يتجلى من خلال تطبيقها لتطوير تحركات غير ATP السيكلين تنافسية تعتمد (للمعلمين) مثبطات كما العلاجات المضادة للورم. وكثيرا ما حررت CDKs في السرطان، وبالتالي تعتبر أهدافا هامة للتنمية المخدرات. تم الإبلاغ عن تثبيط CDK2 / السيكلين A في المرحلة S لتعزيز موت الخلايا المبرمج انتقائية من الخلايا السرطانية بطريقة مستقلة البروتين p53 من خلال مسار E2F1. استهداف تفاعل البروتين البروتين في المربوطة السيكلينز الأخدود (CBG) هو النهج الذي سيسمح للتثبيط محددة من دورة الخلية على CDKs النسخي. يتم التعرف على CBG عن طريق سلسلة إجماع المستمدة من ركائز معلمين وورم البروتينات الكابتة يسمى السيكلين عزر (CBM) ملزمة. وقد سبق الأمثل CBM إلى ثماني الببتيد من p21Waf (HAKRRIF) ثم اقتطاع المزيد لخماسي الببتيد الاحتفاظ النشاط الكافي (RRLIF). الببتيدات بصفة عامة ليست قابلة للاختراق الخلية، غير مستقرة عملية الأيض وبالتالي تم تطبيق استبدال (مع استبدال الجزئي يجند البدائل من خلال الحاسوبية التخصيب) استراتيجية من أجل توليد المزيد من مثبطات مثل المخدرات. تبدأ استراتيجية مع تصميم جزء ligated الببتيد المثبطة (تقلب) التي تحول دون انتقائية دورة الخلية مجمعات معلمين / السيكلين. تم إنشاء تقلب عن طريق استبدال تكرارا مخلفات HAKRRLIF / RRLIF مع شظية مثل الجزيئات الصغيرة (متوجا مجموعات)، بدءا من N-محطة (Ncaps)، تليها بديل عنمحطة سي. هذه المركبات هي نقطة الانطلاق لتوليد مثبطات معلمين تنافسية غير ATP كما العلاجات المضادة للورم.
Introduction
في هذه المقالة، وصفت دراسة حالة لتطبيق استبدال (استبدال ببدائل يجند جزئية باستخدام الحسابية التخصيب) استراتيجية لتحويل مثبطات ببتيدية من تفاعلات البروتين البروتين إلى مزيد من صيدليا الجزيئات ذات الصلة 1-3. بينما تمثل مثبطات مضخة البروتون مصدرا غنيا لكن مستغلة من الأهداف المحتملة المخدرات والمنهجيات الحالية غير كافية إلى حد كبير لجعل هذه يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. الاستراتيجيات الحالية بما في ذلك جزء يستند تصميم 4، الإنتاجية العالية فحص 5 والببتيدات تدبيس وفرت 6 التقدم، ولكن هذه هي في كثير من الحالات غير فعالة. ونتيجة لذلك، يطلب المزيد من التقدم ونهج أكثر كفاءة. استبدال تم التحقق من صحة تماما في تطوير مثبطات كيناز التي أدت إلى تحسين الخصائص مثل المخدرات ولها إمكانات لمزيد من التطوير كما العلاجات المضادة للورم. ويتمثل هذه الاستراتيجية في تطوير مثبطات غير ATP من الخلاياCDKs دورة وينطوي على النحو التالي: 1) الحصول على المعلومات الهيكلية 3D على تفاعلات HAKRRLIF / RRLIF مع السيكلين الأخدود ملزمة. 2) تحديد محددات ملزمة هامة للتفاعل الببتيد. 3) الاقتطاع من الببتيد N-محطة تحتوي على واحد أو أكثر من محددات ملزمة؛ 4) تحديد الحسابية بدائل جزيء صغير المحتملة (بدائل يجند جزئية، بلاس) للجزء المقتطعة من الببتيد والتي تحتفظ التفاعلات الرئيسية للالببتيد الأم. 5) توقع توليف أو مصادر تجارية البلاس لربط بشوق مع موقع فرعي المحتلة من قبل بقايا الببتيد حذف (ق)؛ 6) توليف تقلب من خلال ربط من أفضل بلاس لالببتيد اقتطاع باستخدام تركيب الحالة الصلبة. 7) اختبار تقلب في في المختبر ملزمة أو فحص وظيفي (الاستقطاب مضان في سياق / السيكلين معلمين) تليها مزيد من التوصيف في مقايسة بقاء الخلية. تمثيل تخطيطي لاستبدال الاستراتيجيههو مبين في الشكل 1 ذ. في هذه المقالة، وتناقش تكرار لاستراتيجية استبدال وتطبيق لCDK2 / السيكلين A وصف بالتفصيل. ويعتقد CDKs أن حررت مباشرة أو غير مباشرة في معظم الأورام وبالتالي تعتبر أهدافا المخدرات سرطان المناسب 7. CDKs تتطلب بالتعاون مع الحلقيات لتفعيل كامل وبعد ذلك الفوسفات البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم دورة الخلية 8. الفئات الرئيسية اثنين من CDKs هي isotypes التي تتحكم في نقاط التفتيش دورة الخلية [G1 / S (CDK4 / السيكلين D، CDK6 / السيكلين D وCDK4 / السيكلين E)، مرحلة S (CDK2 / السيكلين A) وG2 / M (CDK1 / السيكلين B)] والمنظمين من RNA البلمرة من خلال الفسفرة (CDK7 / السيكلين H، CDK8 / السيكلين C، CDK9 / السيكلين T). خطوة رئيسية في S مرحلة تطور يحدث عندما يشكل عامل E2F1 النسخ مجمع مع البروتين الذي يربط موانئ دبي ثم إلى DNA ويبدأ النسخ الجيني. مطلوب CDK2 / السيكلين A لتحييد E2F1 النسخيالنشاط خلال الفسفرة مما يؤدي إلى الإفراج عن مجمع E2F1-DP وتدهور لاحقا. ويعتقد تثبيط CDK2 / السيكلين A للحفاظ على E2F1 في DNA حالته ملزمة مما يؤدي إلى تنشيط دائم. فإن مستوى الناتجة من E2F-1 النشاط تتجاوز الحد الأدنى المطلوب للحث على البروتين p53 الخلايا المستقلة بالتالي يشير إلى استراتيجية علاجية. بسبب البروتين p53 حررت ومسارات PRB، ومستويات عالية من E2F-1 تحدث بشكل متكرر في الخلايا السرطانية وتثبيط CDK2 / السيكلين A ينبغي أن يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج انتقائية في الأورام ويمكن اعتباره هدفا سرطان صادق 7.
سريريا مثبطات معلمين التحقيق تستهدف موقع ATP الحفظ جدا ملزمة مما يؤدي إلى عبور التفاعل بين تحركات البروتينات أكبر من 500 في kinome الإنسان ويحتمل أن تكون مما أدى إلى آثار جانبية وسمية 9. نهج بديل غير قابلة للATP تثبيط المنافسة من خلال استهداف توظيف الركيزة خلال CBGموجودة على السيكلين فرعية التنظيمية الإيجابية والتي هي بالتالي متميزة وبعيدة عن موقع ATP 10،11 ملزمة. وCBG هو في المقام الأول الأخدود مسعور الحالي في السيكلين A، D السيكلين والسيكلين E ولقد ثبت للتعرف على تسلسل إجماع وجدت في ركائز والمكثفات الورم. كما الببتيد معزولة، والسيكلين ملزمة عزر (CBM) بربط CBG ولقد ثبت لكبح النشاط كيناز من CDKs دورة الخلية. وقد تم تحسين CBM إلى ثماني الببتيد (HAKRRLIF، CDK2 / السيكلين A IC 50 0.07 ± 0.02 ميكرومتر، CDK4 / السيكلين D، IC 50 0.88 ± 0.34 ميكرومتر) واقتطاع علاوة على ذلك لخماسي الببتيد تمثل حلا وسطا جيدا بين الوزن الجزيئي للبالمخدرات الشبه ورجولية (RRLIF، CDK2 / السيكلين A IC 50 1.01 ± 0.17 ميكرومتر، CDK4 / السيكلين D، IC 50 25.12 ± 2.97 ميكرومتر) 12،13. تتألف CBGs من الانتخابات التمهيدية كبير وجيب مسعور الثانوي أصغر التي يتم سدها من قبل الحمضةج المنطقة (تشمل Glu220، Glu224 وAsp283). وتشمل محددات ملزمة الرئيسية HAKRRLIF تفاعل Ala2 مع السندات جيب مسعور الثانوي، الاقتران أيون الهيدروجين وللLys3، الارجنتين 4 و Arg5 مع المنطقة الحمضية وعلى درجة عالية من التكامل بين Leu6 وPhe8 مع موقع دهون الأساسي. بالإضافة إلى ذلك، ساهم السندات الهيدروجين العديد من العمود الفقري الببتيد في حين يعمل Ile7 كبقايا هل يسمح اتصال الأمثل مع جيب الأساسي. يظهر وضع ملزمة وتفاعلات HAKRRLIF مع CBG في الشكل 2.
سوف تستهدف CBM / CBG تفاعل البروتين البروتين تمنع النشاط كيناز من CDK2 / السيكلين A، CDK2 / السيكلين E & CDK4 / السيكلين D وهذا ينبغي أن يؤدي E2F1 الخلايا بوساطة الخلايا السرطانية في حين لا تؤثر الخلايا الطبيعية 7. على الرغم من أن CBM المستمدة الببتيدات هي مثبطات فعالة من CDKs دورة الخلية، فمن غير المحتمل أن يكون مفيدا كدواء بسبب الايضعدم الاستقرار ونقص عام في نفاذية الخلية. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطبيق استراتيجية استبدالها من أجل تحويل هذه المثبطات ببتيدية واسعا إلى مزيد من مركبات شبيهة المخدرات للحصول على مزيد من العلاجات المضادة للورم استغلال E2F1 حررت خلال CDK2 / السيكلين A تثبيط التنمية. بروتوكول التالية يلخص العمل الذي تم الانتهاء منه في تطبيق استبدال لالأخدود السيكلين. في المقام الأول، تم تحديد بدائل فريق السد مثل المخدرات للرباعي البيبتيد N-محطة من HAKRRLIF. وعلاوة على ذلك تم التحقيق التحسينات في هذه المجموعات في دراسة التحقق من صحة إضافية لاستبدال. وتعرض أيضا ممثل النتائج من هذه الدراسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr’s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.
Materials
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, , Micro pipets, | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT), | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates, | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent, | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter. | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Riferimenti
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of ‘druggable’ targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
