Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo

Summary

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Abstract

REPLACE è una strategia unica sviluppata per indirizzare più efficacemente le interazioni proteina-proteina (PPI). Ha lo scopo di ampliare lo spazio disponibile altro obiettivo fornendo una migliore metodologia per l'identificazione di inibitori di tali siti di legame e che rappresentano la maggior parte dei potenziali bersagli farmacologici. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di fornire una visione metodologica di utilizzo e applicazione della strategia REPLACE che prevede approcci di chimica computazionale e sintetiche. Replace è esemplificata attraverso la sua applicazione allo sviluppo di non-ATP chinasi ciclina dipendenti competitivo (CDK) inibitori come terapie antitumorali. CDK sono spesso deregolamentati nel cancro e, quindi, sono considerati come obiettivi importanti per lo sviluppo di farmaci. Inibizione di CDK2 / ciclina A in fase S è stato segnalato a promuovere l'apoptosi selettiva delle cellule tumorali in modo indipendente p53 attraverso la via E2F1. Targeting l'interazione proteina-proteina in bindin ciclinag scanalatura (CBG) è un approccio che permetterà l'inibizione specifica del ciclo cellulare nel corso CDK trascrizionali. La CBG è riconosciuto da una sequenza consenso derivato da substrati CDK e proteine ​​oncosoppressori definito il legame motivo (CBM) ciclina. Il CBM è stato precedentemente ottimizzato per un octapeptide da p21Waf (HAKRRIF) e poi ulteriormente troncato ad un pentapeptide ritegno sufficiente attività (RRLIF). Peptidi, in generale, non sono delle cellule permeabili, sono metabolicamente instabile e quindi il REPLACE (sostituzione con Parziale Ligand Alternative attraverso computazionale arricchimento) strategia è stata applicata al fine di generare inibitori più farmaco-simili. La strategia inizia con la progettazione di Frammento legatura peptidi inibitori (flip), che inibiscono selettivamente ciclo cellulare complessi CDK / ciclina. Capovolge sono stati generati da iterativamente sostituendo residui di HAKRRLIF / RRLIF con frammento come piccole molecole (gruppi capping), a partire dalla N-terminale (Ncaps), seguita da sostituzione inil C-terminale. Questi composti sono punti di partenza per la generazione di non-ATP inibitori CDK competitivi come terapie anti-tumorali.

Introduction

In questo articolo, un caso di studio di applicare il REPLACE (sostituzione con alternative ligando parziali utilizzando computazionale arricchimento) strategia per convertire inibitori peptidici di interazioni proteina-proteina in più molecole farmacologicamente rilevanti è descritta ^1-3. Mentre PPI rappresentano una ricca ma poco sfruttato fonte di potenziali bersagli farmacologici, metodologie esistenti sono largamente insufficienti a rendere questi ampiamente accessibile. Le attuali strategie, tra cui frammento basato ^design a 4, high-throughput di screening ⁵ e peptidi pinzati ^{6 sono} previsti anticipi, ma questi sono in molti casi inefficace. Di conseguenza, sono necessari ulteriori progressi e approcci più efficienti. SOSTITUIRE è stato pienamente convalidato per lo sviluppo di inibitori della chinasi che hanno migliorato le proprietà farmaco-simili e hanno il potenziale per un ulteriore sviluppo come terapie antitumorali. Questa strategia è esemplificato nello sviluppo di inibitori non-ATP della cellaCDK ciclabili e coinvolge i seguenti: 1) ottenere informazioni strutturali 3D sulle interazioni di HAKRRLIF / RRLIF con la ciclina solco vincolante; 2) determinare i fattori determinanti vincolanti per l'interazione peptide; 3) troncamento del peptide N-terminale contenente uno o più determinanti vincolanti; 4) identificazione di potenziali computazionale piccole molecole alternative (alternative ligando parziali, PLA) per la parte troncata del peptide e che mantengono interazioni chiave del peptide controllante; 5) sintesi o approvvigionamento commerciale di PLA previsto di impegnare avidamente con il sito sub precedentemente occupato da residuo peptide soppresso (s); 6) sintesi di sfoglia legatura dei migliori PLA al peptide troncato utilizzando sintesi in fase solida; 7) prove di lanci in un in vitro di legame o saggio funzionale (polarizzazione di fluorescenza nel contesto / ciclina CDK), seguita da un'ulteriore caratterizzazione in un test di vitalità cellulare. Una rappresentazione schematica di REPLACE strategy è mostrato in Figura 1. In questo articolo, iterazioni della strategia REPLACE sono discussi e l'applicazione di CDK2 / ciclina A descritto in dettaglio. CDK si crede di essere, direttamente o indirettamente deregolato nella maggior parte dei tumori e sono quindi considerati bersagli tumorali appropriata droga ^7. CDK richiede associazione con cicline per la piena attivazione e successivamente fosforilare proteine ​​chiave coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare ^8. I due principali gruppi di CDK sono gli isotipi che controllano i punti di controllo del ciclo cellulare [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e le autorità di regolamentazione di RNA polimerasi, attraverso la fosforilazione (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Un passaggio chiave nella progressione fase S si verifica quando il fattore di trascrizione E2F1 forma un complesso con la proteina DP, che poi si lega al DNA e inizia la trascrizione del gene. CDK2 / ciclina A è necessario per neutralizzare E2F1 trascrizionaleattività attraverso la fosforilazione determinando così liberare del complesso E2F1-DP e la sua successiva degradazione. Inibizione di CDK2 / ciclina A si ritiene di mantenere E2F1 nel suo stato legato DNA che porta all'attivazione persistente. Del conseguente livello di E2F-1 supererà la soglia necessaria per indurre l'apoptosi p53 indipendente suggerendo quindi una strategia terapeutica. A causa di p53 deregolamentato e percorsi pRb, alti livelli di E2F-1 spesso si verificano nelle cellule tumorali e l'inibizione della CDK2 / ciclina A dovrebbe portare all'apoptosi selettivi nei tumori e può essere considerato come un obiettivo cancro convalidato ^7.

Clinicamente inibitori CDK indagati bersaglio il sito altamente conservata ATP legame che porta ad attraversare reattività tra le proteine ​​chinasi maggiore di 500 nel kinome umano e potenzialmente dando luogo a effetti collaterali e la tossicità ^9. Un approccio alternativo è non-ATP inibizione competitiva di mira substrato reclutamento attraverso il CBGpresente su ciclina subunità normativo positivo, e che è quindi distinto e distante dal sito ATP ^10,11 vincolante. La CBG è principalmente un solco idrofobico presente in ciclina A, ciclina D e ciclina E e ha dimostrato di riconoscere una sequenza di consenso trovata in substrati e soppressori tumorali. Come un peptide isolato, il legame ciclina motivo (CBM) si lega al CBG e ha dimostrato di inibire l'attività chinasica del CDK ciclo cellulare. Il CBM è stato ottimizzato per un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A _IC50 0,07 ± 0,02 micron, CDK4 / ciclina _D, IC50 0,88 ± 0,34 micron) e inoltre troncato a un pentapeptide che rappresenta un buon compromesso tra peso molecolare per droga somiglianza e potenza (RRLIF, CDK2 / ciclina A _IC50 1,01 ± 0,17 micron, CDK4 / ciclina _D, IC50 25.12 ± 2.97 micron) ^12,13. I CBGs costituiti da un grande primario e più piccola tasca idrofobica secondario che sono collegate da un ACIDIc regione (include Glu220, Glu224 e Asp283). Le principali determinanti vincolanti HAKRRLIF includono l'interazione dei Ala2 con la tasca idrofoba secondaria, accoppiamento ionico e legami di idrogeno Lys3, Arg 4 e Arg5 con la regione acida e un alto grado di complementarità di Leu6 e Phe8 con il sito primario lipofilo. Inoltre, numerosi legami idrogeno sono fornite dal scheletro peptidico mentre Ile7 agisce come residuo spaziatore consente un contatto ottimale con la tasca principale. La modalità di rilegatura e le interazioni di HAKRRLIF con CBG è mostrato nella Figura 2.

Targeting l'interazione proteina-proteina CBM / CBG inibisce l'attività chinasi CDK2 / ciclina A, CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e questo dovrebbe far scattare E2F1 apoptosi mediata delle cellule tumorali mentre non interessano le cellule normali ^7. Anche se CBM derivati ​​peptidi sono efficaci inibitori di CDK ciclo cellulare, è improbabile che essi saranno utili come farmaci a causa del loro metabolismoinstabilità e mancanza generale di permeabilità cellulare. A tal fine, abbiamo applicato la strategia REPLACE al fine di convertire questi inibitori peptidici potenti in più composti farmaco-simili per l'ulteriore sviluppo di terapie antitumorali sfruttando E2F1 liberalizzato attraverso CDK2 / ciclina A inibizione. Il protocollo seguente riassume lavoro che è stato completato l'applicazione della REPLACE alla scanalatura ciclina. Nel primo caso, sono state identificate sostituzioni gruppo capping-farmaci per il tetrapeptide N-terminale di HAKRRLIF. Inoltre, i miglioramenti in questi gruppi sono stati esaminati in un ulteriore studio di validazione per REPLACE. Risultati rappresentativi di questi studi sono anche presentati.

Protocol

1. computazionale identificazione di potenziali piccola molecola Tappatrici gruppi Nota: In linea di principio, una varietà di attracco o farmacofori metodi di ricerca può essere utilizzato per prevedere i potenziali gruppi di tappatura. Lo scopo principale di studi computazionali in REPLACE è quello di identificare piccole molecole che mantengono le caratteristiche e le interazioni degli aminoacidi che vengono sostituiti. Validazione del protocollo LigandFit attracco 14</…

Representative Results

Le interazioni di HAKRRLIF con scanalatura ciclina sono mostrati in Figura 2. I residui peptidici che rappresentano le principali determinanti di legame includono Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 con altri residui fornendo contributi piccole 12,13,18. In questo caso di studio la strategia REPLACE è stato utilizzato al fine di trovare alternative frammento di residui nel tetrapeptide N-terminale HAKRRLIF, imitando soprattutto le interazioni di Ala2 e Arg4. Una libreria di potenziali f…

Discussion

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts¹⁹. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability²⁰. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…

Materials

Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, ,  Micro pipets,	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70c freezer	Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector  fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates,	Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines	ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,  MTT reagent,	Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer	VWR
-70c freezer	Revco (Ultima II)
Incubator	Thermo electron corporation
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Refrigerator 4-8C	Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.	Beckman Coulter, Brea, CA