Développement d'inhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP

Summary

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Abstract

REPLACE est une stratégie unique développé pour cibler plus efficacement les interactions protéine-protéine (IPP). Il vise à élargir l'espace disponible de médicament cible en fournissant une meilleure méthodologie pour l'identification d'inhibiteurs de ces sites de liaison et qui représentent la majorité des cibles potentielles de médicaments. L'objectif principal de ce document est de fournir un aperçu de la méthodologie de l'utilisation et l'application de la stratégie REMPLACER qui implique des approches de calculs de chimie et synthétiques. REPLACE est illustré par son application au développement de kinases cycline non-ATP concurrentiel dépendantes (CDK) inhibiteurs comme agents thérapeutiques anti-tumorales. CDK sont souvent déréglementés dans le cancer et sont donc considérés comme des cibles importantes pour le développement de médicaments. L'inhibition de la CDK2 / cycline A dans la phase S a été rapporté à favoriser l'apoptose sélective des cellules cancéreuses de manière indépendante de p53 par la voie de E2F1. Le ciblage interaction protéine-protéine à la cycline binding rainure (GBC) est une approche qui permettra à l'inhibition spécifique du cycle cellulaire sur CDK transcription. La CBG est reconnu par une séquence consensus dérivée à partir de substrats de CDK et des protéines suppresseurs de tumeur appelé le motif de liaison (CBM) cycline. Le CBM a déjà été optimisé pour un octapeptide de p21Waf (HAKRRIF), puis encore tronqué à un pentapeptide conservant une activité suffisante (RRLIF). Peptides en général ne sont pas cellule perméable, sont métaboliquement instable et donc la REPLACE (remplacement partiel avec Ligand Alternatives travers Computational enrichissement) stratégie a été appliquée afin de générer plusieurs inhibiteurs de drug-like. La stratégie commence avec la conception du fragment ligaturé peptides inhibiteurs (de flips) qui inhibent sélectivement cycle cellulaire des complexes CDK / cycline. FLIP ont été générés par le remplacement itérative résidus de HAKRRLIF / RRLIF avec le fragment comme de petites molécules (groupes de recouvrement), à partir de l'extrémité N-terminale (Ncaps), suivis par le remplacement surl'extrémité C-terminale. Ces composés sont des points de départ pour la production d'inhibiteurs de CDK non compétitifs de l'ATP comme agents thérapeutiques anti-tumorales.

Introduction

Dans cet article, une étude de l'application de la REPLACE (remplacement par des alternatives ligand partielle à l'aide de calcul enrichissement) stratégie visant à convertir des inhibiteurs peptidiques de interactions protéine-protéine en plus de molécules pharmaceutiquement pertinents cas est décrit ^1-3. Bien que les IPP représentent une source de cibles potentielles de médicaments, mais sous-exploité riche, méthodologies existantes sont largement insuffisants pour faire de ces largement accessible. Les stratégies actuelles, y compris fragment conception basée sur ^4, criblage à haut débit ^{5 et 6} peptides agrafées ont apporté des progrès, mais ceux-ci sont dans de nombreux cas inefficaces. En conséquence, davantage de progrès et des approches plus efficaces sont nécessaires. REPLACE a été entièrement validée dans le développement d'inhibiteurs de kinases qui ont des propriétés améliorées de drug-like et qui ont un potentiel de développement en tant qu'agents thérapeutiques anti-tumorales. Cette stratégie est illustrée dans le développement d'inhibiteurs non-ATP de cellulesCDK de cycle et implique comme suit: 1) l'obtention d'informations structurelles 3D sur les interactions de HAKRRLIF / RRLIF sillon de liaison avec la cycline; 2) déterminer les déterminants de liaison importants pour l'interaction peptidique; 3) la troncature du peptide N-terminale contenant un ou plusieurs déterminants de liaison; 4) l'identification de calcul de potentiels de petites molécules variantes alternatives (ligands partiels, PLA) pour la partie tronquée du peptide et qui conservent les interactions clés du peptide parent; 5) la synthèse ou l'approvisionnement commercial de PLA prédits se lier avidement avec le sous-site précédemment occupée par le résidu (s) peptidique est supprimé; 6) synthèse de feuillette ligature des meilleurs PLA au peptide tronqué en utilisant une synthèse en phase solide; 7) Les essais de culbutes dans un liant in vitro ou un dosage fonctionnel (polarisation de fluorescence dans le contexte / cycline CDK), suivie d'une caractérisation plus poussée dans un essai de viabilité des cellules. Une représentation schématique de REMPLACER stratégy est montré dans la figure 1. Dans cet article, itérations de la stratégie REPLACE sont discutés et l'application de CDK2 / cycline A décrit en détail. CDK sont soupçonnés d'être directement ou indirectement déréglementé dans la majorité des tumeurs et sont donc considérés cancer appropriée cibles médicamenteuses ^7. CDK nécessite association avec cyclines pour l'activation complète et phosphorylent ensuite protéines clés impliquées dans la régulation du cycle cellulaire ^8. Les deux principaux groupes de CDK sont les isotypes et qui éliminent les points de contrôle du cycle cellulaire [G1 / S (CDK4 / cycline D, CDK6 / cycline D et CDK4 / cycline E), la phase S (CDK2 / cycline A) et G2 / M (CDK1 / cycline B)] et les régulateurs de l'ARN polymérase par phosphorylation (CDK7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Une étape clé dans la progression de la phase S se produit lorsque le facteur de transcription E2F1 forme un complexe avec la protéine DP qui se lie ensuite à l'ADN et initie la transcription du gène. CDK2 / cycline A est nécessaire pour neutraliser la transcription E2F1activité à travers la phosphorylation conduisant ainsi à libérer du complexe E2F1-DP et sa dégradation ultérieure. L'inhibition de CDK2 / cycline A est censé maintenir E2F1 dans son état ADN lié à l'activation persistante conduisant. Le niveau résultant de l'E2F-1 l'activité dépassera le seuil nécessaire pour induire l'apoptose p53 indépendante suggérant donc une stratégie thérapeutique. En raison de p53 et dérégulé voies pRb, des niveaux élevés de l'E2F-1 se produisent fréquemment dans les cellules cancéreuses et l'inhibition de la CDK2 / cycline A doit conduire à l'apoptose sélective dans les tumeurs et peut être considéré comme une cible de cancer validée ^7.

Cliniquement inhibiteurs de CDK étudiés ciblent le site hautement conservée ATP liaison menant à traverser la réactivité parmi les plus de 500 protéines kinases dans le kinome humaine et qui pourrait donner lieu à des effets et de la toxicité ^{9 Side.} Une autre approche est non-ATP inhibition compétitive en ciblant le recrutement de substrat à travers la CBGprésent sur ​​la cycline sous-unité régulatrice positive et qui est donc distincte et distante de l'ATP site de liaison ^10,11. Le CBG est principalement hydrophobe présente une rainure dans la cycline A, la cycline D et la cycline E et a été montré pour reconnaître une séquence consensus trouvée dans les substrats et des suppresseurs de tumeurs. Comme un peptide isolé, le motif de liaison de la cycline (CBM) se lie à la CBG et a été montré pour inhiber l'activité de kinase de CDK du cycle cellulaire. Le CBM a été optimisé pour un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A IC ₅₀ de 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC ₅₀ de 0,88 ± 0,34 M) et, en outre tronquée à un pentapeptide qui représente un bon compromis entre le poids moléculaire de la drogue la ressemblance et de la puissance (RRLIF, CDK2 / cycline A IC ₅₀ de 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC ₅₀ 25,12 ± 2,97 uM) ^12,13. Les GBC composent d'une grande primaire et secondaire plus petite poche hydrophobe qui sont comblé par une acidic région (comprend Glu220, Glu224 et Asp283). Les déterminants de liaison clés de HAKRRLIF comprennent l'interaction de Ala2 avec les liaisons poche hydrophobe secondaire, appariement d'ions et d'hydrogène de Lys3, Arg 4 et arg5 avec la région acide et un degré élevé de complémentarité de Leu6 et Phe8 avec le site lipophile primaire. En outre, de nombreuses liaisons hydrogène sont contribué au squelette du peptide tandis Ile7 agit comme un résidu d'écartement permettant un contact optimal avec la poche primaire. Le mode de fixation et les interactions des HAKRRLIF avec CBG est montré dans la figure 2.

Cibler le CBM / CBG interaction protéine-protéine inhibe l'activité kinase de CDK2 de / cycline A, CDK2 / cycline E et CDK4 / cycline D, ce qui devrait déclencher l'apoptose à médiation par E2F1 des cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales ^7. Bien que CBM peptides dérivés sont des inhibiteurs efficaces de CDK du cycle cellulaire, il est peu probable qu'ils soient utiles comme médicaments en raison de leur métabolismel'instabilité et le manque général de la perméabilité cellulaire. À cette fin, nous avons appliqué la stratégie REPLACE afin de convertir ces inhibiteurs peptidiques puissants dans plusieurs composés de drogues pour la poursuite du développement de produits thérapeutiques anti-tumorales exploitant E2F1 déréglementé travers CDK2 / cycline A inhibition. Le protocole suivant résume travail qui a été accompli dans l'application de REPLACE à la gorge de la cycline. Dans le premier cas, le remplacement des groupes de plafonnement des drogues pour le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF ont été identifiés. En outre des améliorations dans ces groupes ont été étudiés dans une étude de validation supplémentaire pour REPLACE. Les résultats représentatifs de ces études sont également présentés.

Protocol

1. Computational identification du potentiel à petites molécules des groupes de recouvrement Remarque: En principe, une variété de pharmacophores accueil ou méthodes de recherche peut être utilisé pour prédire les groupes de coiffage potentiels. Le but principal de calcul dans REMPLACER études est d'identifier de petites molécules qui conservent les caractéristiques et les interactions des acides aminés qui sont substitués. Validation du protocole LigandFit d'…

Representative Results

Les interactions de HAKRRLIF avec la rainure de la cycline sont présentés sur la figure 2. Les résidus peptidiques qui représentent les principaux déterminants de liaison comprennent Ala2, Arg4, Leu6 et Phe8 par d'autres résidus de fournir des contributions de plus petites 12,13,18. Dans cette étude de cas la stratégie REPLACE a été utilisée dans le but de trouver des alternatives fragments pour les résidus dans le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF, imitan…

Discussion

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts¹⁹. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability²⁰. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…

Materials

Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, ,  Micro pipets,	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70c freezer	Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector  fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates,	Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines	ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,  MTT reagent,	Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer	VWR
-70c freezer	Revco (Ultima II)
Incubator	Thermo electron corporation
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Refrigerator 4-8C	Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.	Beckman Coulter, Brea, CA