के माध्यम से जगह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अवरोधकों की विकास: डिजाइन और विकास गैर एटीपी प्रतियोगी CDK अवरोधकों के आवेदन
Summary
We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.
Abstract
अधिक प्रभावी ढंग से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) को लक्षित करने के लिए विकसित एक अद्वितीय रणनीति की जगह है। यह संभावित दवा लक्ष्यों के बहुमत का प्रतिनिधित्व ऐसी बाध्यकारी साइटों के लिए अवरोधकों की पहचान और जिसके लिए पद्धति में सुधार कराने के द्वारा उपलब्ध दवा लक्ष्य अंतरिक्ष का विस्तार करना है। इस पत्र का मुख्य लक्ष्य कम्प्यूटेशनल और सिंथेटिक रसायन विज्ञान के दृष्टिकोण शामिल है जो जगह रणनीति के उपयोग और आवेदन की एक पद्धति सिंहावलोकन प्रदान करना है। गैर एटीपी प्रतिस्पर्धी cyclin निर्भर kinases (CDK) विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के रूप में अवरोधकों के विकास के लिए अपने आवेदन के माध्यम से उदाहरण है जगह। CDKs अक्सर कैंसर में नियंत्रण मुक्त कर रहे हैं और इसलिए दवा के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में माना जाता है। एस चरण में CDK2 / cyclin एक का निषेध E2F1 मार्ग के माध्यम से एक p53 स्वतंत्र ढंग से कैंसर कोशिकाओं के चुनिंदा एपोप्टोसिस बढ़ावा देने के लिए सूचित किया गया है। Cyclin bindin में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लक्ष्य निर्धारणजी नाली (सीबीजी) ट्रांसक्रिप्शनल CDKs से अधिक सेल चक्र के विशिष्ट निषेध की अनुमति होगी जो एक दृष्टिकोण है। सीबीजी CDK substrates और ट्यूमर शमन प्रोटीन से ली गई एक आम सहमति अनुक्रम द्वारा मान्यता प्राप्त है मूल भाव (सीबीएम) बाध्यकारी cyclin करार दिया। सीबीएम पहले से आगे पर्याप्त गतिविधि (RRLIF) को बनाए रखना एक pentapeptide को छोटा कर दिया तो p21Waf (HAKRRIF) और से एक octapeptide करने के लिए अनुकूलित किया गया है। पारगम्य सेल नहीं कर रहे हैं सामान्य में पेप्टाइड्स, पाचन अस्थिर और इसलिए रणनीति की जगह (कम्प्यूटेशनल संवर्धन के माध्यम से आंशिक Ligand विकल्प के साथ रिप्लेसमेंट) अधिक दवा की तरह अवरोधकों को उत्पन्न करने के क्रम में लागू किया गया है। रणनीति चुनिंदा कोशिका चक्र CDK / cyclin परिसरों बाधित कि टुकड़ा ligated निरोधात्मक पेप्टाइड (flips) के डिजाइन के साथ शुरू होता है। Flips, iteratively एन टर्मिनस (Ncaps) से शुरू होने वाले छोटे अणुओं (समूहों कैपिंग), जैसे टुकड़ा के साथ HAKRRLIF / RRLIF के अवशेषों की जगह से उत्पन्न पर प्रतिस्थापन द्वारा पीछा किया गयासी टर्मिनस। इन यौगिकों विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के रूप में गैर एटीपी प्रतिस्पर्धी CDK अवरोधकों की पीढ़ी के लिए अंक शुरू कर रहे हैं।
Introduction
इस अनुच्छेद में, अधिक pharmaceutically प्रासंगिक अणुओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की peptidic अवरोधकों को परिवर्तित करने के लिए रणनीति की जगह (कम्प्यूटेशनल संवर्धन का उपयोग कर आंशिक ligand के विकल्प के साथ रिप्लेसमेंट) को लागू करने के एक मामले का अध्ययन 1-3 वर्णन किया गया है। पीपीआई संभावित दवा लक्ष्यों की एक अमीर लेकिन underexploited स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं, मौजूदा तरीके में इन व्यापक रूप से सुलभ बनाने के लिए काफी हद तक अपर्याप्त हैं। टुकड़ा आधारित डिजाइन 4, उच्च throughput स्क्रीनिंग 5 और 6 अग्रिमों प्रदान की है नत्थी पेप्टाइड्स सहित वर्तमान रणनीतियों, हालांकि इनमें से कई मामलों में अप्रभावी कर रहे हैं। नतीजतन, अधिक प्रगति और अधिक कुशल दृष्टिकोण की आवश्यकता है। पूरी तरह से दवा के समान गुणों में सुधार हुआ और विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के रूप में आगे के विकास के लिए क्षमता है है कि काइनेज अवरोधकों के विकास में मान्य किया गया है जगह। इस रणनीति के सेल की गैर एटीपी अवरोधकों के विकास में उदाहरण हैचक्र CDKs और के रूप में शामिल हैं: 1) cyclin नाली बंधन के साथ HAKRRLIF / RRLIF की बातचीत पर 3 डी संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के; 2) पेप्टाइड बातचीत के लिए महत्वपूर्ण बाध्यकारी निर्धारकों का निर्धारण; एक या एक से अधिक बाध्यकारी निर्धारकों युक्त पेप्टाइड एन टर्मिनस के 3) ट्रंकेशन; पेप्टाइड और जिनमें से छोटा कर दिया हिस्से के लिए संभावित छोटे अणु विकल्पों में से 4) कम्प्यूटेशनल पहचान (आंशिक ligand के विकल्प, Plas) माता-पिता पेप्टाइड की कुंजी बातचीत बनाए रखने; 5) संश्लेषण या Plas के वाणिज्यिक सोर्सिंग पहले से नष्ट पेप्टाइड छाछ (एस) के कब्जे में उप साइट के साथ उत्सुकतापूर्वक बाध्य करने के लिए भविष्यवाणी की; 6) ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग कर छोटा कर दिया पेप्टाइड करने के लिए सबसे अच्छा Plas की बंधाव के माध्यम से flips के संश्लेषण; बाध्यकारी इन विट्रो में flips या एक सेल व्यवहार्यता परख में आगे लक्षण वर्णन के द्वारा पीछा कार्यात्मक परख (CDK / cyclin संदर्भ में प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण) के 7) परीक्षण। रणनीति की जगह का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्ववाई। चित्रा 1 में दिखाया गया है इस लेख में, बदलें रणनीति की पुनरावृत्तियों चर्चा कर रहे हैं और CDK2 / cyclin एक करने के लिए आवेदन में विस्तार से वर्णन किया। CDKs प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से ट्यूमर के बहुमत में नियंत्रण मुक्त होने का विश्वास कर रहे हैं और इसलिए उचित कैंसर की दवा लक्ष्यों 7 माना जाता है। CDKs पूर्ण क्रियान्वयन के लिए cyclins के सहयोग की आवश्यकता होती है और बाद में सेल चक्र विनियमन 8 में शामिल प्रमुख प्रोटीन phosphorylate। CDKs के दो प्रमुख समूहों सेल चक्र चौकियों पर नियंत्रण है कि आइसोटाइप [G1 / एस (CDK4 / Cyclin डी, CDK6 / cyclin डी और CDK4 / cyclin ई), एस चरण (CDK2 / cyclin ए) और G2 / एम (CDK1 / कर रहे हैं cyclin बी)] और फास्फोरिलीकरण के माध्यम से शाही सेना पोलीमरेज़ के नियामकों (CDK7 / cyclin एच, CDK8 / cyclin सी, CDK9 / cyclin टी)। E2F1 प्रतिलेखन कारक तो डीएनए को बांधता है और जीन प्रतिलेखन शुरू की जो डीपी प्रोटीन के साथ एक जटिल रूपों जब एस चरण प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम होता है। CDK2 / cyclin एक E2F1 ट्रांसक्रिप्शनल बेअसर करने के लिए आवश्यक हैफास्फोरिलीकरण के माध्यम से गतिविधि जिससे E2F1-डी पी जटिल और इसके बाद के क्षरण की रिहाई के लिए अग्रणी। CDK2 / cyclin एक का निषेध इसकी डीएनए बाध्य राज्य लगातार सक्रियण के लिए अग्रणी में E2F1 बनाए रखने के लिए माना जाता है। E2F -1 गतिविधि के एवज स्तर इसलिए एक चिकित्सकीय रणनीति का सुझाव p53 स्वतंत्र apoptosis प्रेरित करने के लिए आवश्यक सीमा को पार करेंगे। कारण E2F -1 का नियंत्रण मुक्त p53 और PRB रास्ते, उच्च स्तर के लिए बार-बार ट्यूमर में चयनात्मक एपोप्टोसिस के लिए नेतृत्व चाहिए कैंसर की कोशिकाओं और CDK2 / cyclin एक के निषेध में होते हैं और एक मान्य कैंसर लक्ष्य 7 के रूप में माना जा सकता है।
चिकित्सकीय जांच CDK अवरोधकों मानव kinome में 500 से अधिक प्रोटीन kinases के बीच जेट को पार करने के लिए अग्रणी अत्यधिक संरक्षित एटीपी बाध्यकारी साइट को निशाना बनाने और संभावित प्रभाव और विषाक्तता 9 पक्ष को जन्म दे रही है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीबीजी के माध्यम से सब्सट्रेट भर्ती लक्षित करके गैर एटीपी प्रतिस्पर्धी निषेध हैcyclin सकारात्मक विनियामक सबयूनिट पर वर्तमान और इसलिए अलग और साइट 10,11 बाध्यकारी एटीपी से दूर है। सीबीजी मुख्य रूप से cyclin ए, cyclin डी और cyclin ई में मौजूद एक हाइड्रोफोबिक नाली है और substrates और ट्यूमर शामक में पाया जाने वाला एक आम सहमति अनुक्रम पहचान करने के लिए दिखाया गया है। एक अलग पेप्टाइड के रूप में, cyclin बाध्यकारी मूल भाव (सीबीएम) सीबीजी को बांधता है और कोशिका चक्र CDKs की काइनेज गतिविधि को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। सीबीएम दवा के लिए आणविक वजन के बीच एक अच्छा समझौता प्रतिनिधित्व करने वाले एक pentapeptide करने के लिए इसके अलावा छोटा (HAKRRLIF, CDK2 / cyclin एक आईसी 50 0.07 ± 0.02 माइक्रोन, CDK4 / cyclin डी आईसी 50 0.88 ± 0.34 माइक्रोन) के एक octapeptide करने और अनुकूलित किया गया है समानता और शक्ति (RRLIF, CDK2 / cyclin एक आईसी 50 1.01 ± 0.17 माइक्रोन, CDK4 / cyclin डी, आईसी 50 25.12 ± 2.97 माइक्रोन) 12,13। CBGs एक acidi से पाट कर रहे हैं जो एक बड़े प्राथमिक और छोटे माध्यमिक हाइड्रोफोबिक जेब से मिलकर बनता हैग क्षेत्र (Glu220, Glu224 और Asp283 भी शामिल है)। HAKRRLIF की कुंजी बाध्यकारी निर्धारकों अम्लीय क्षेत्र और प्राथमिक lipophilic साइट के साथ Leu6 और Phe8 के पूरक के एक उच्च डिग्री के साथ Lys3, Arg 4 और Arg5 के माध्यमिक हाइड्रोफोबिक जेब, आयन बाँधना और हाइड्रोजन बांड के साथ Ala2 की बातचीत में शामिल हैं। Ile7 प्राथमिक जेब के साथ इष्टतम संपर्क की अनुमति एक स्पेसर अवशेषों के रूप में कार्य करता है, जबकि इसके अलावा, कई हाइड्रोजन बांड पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी से योगदान कर रहे हैं। बाध्यकारी मोड और सीबीजी साथ HAKRRLIF की बातचीत चित्रा 2 में दिखाया गया है।
सीबीएम / सीबीजी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को टारगेट कर CDK2 / cyclin ए, CDK2 / cyclin ई एंड CDK4 / cyclin डी के kinase गतिविधि को बाधित करेगा और सामान्य कोशिकाओं 7 को प्रभावित नहीं है, जबकि इस E2F1 कैंसर की कोशिकाओं की मध्यस्थता एपोप्टोसिस को गति प्रदान करना चाहिए। सीबीएम व्युत्पन्न पेप्टाइड्स कोशिका चक्र CDKs के प्रभावी अवरोधकों कर रहे हैं, यह है कि वे की वजह से उनके चयापचय को दवाओं के रूप में उपयोगी हो जाएगा संभावना नहीं हैअस्थिरता और सेल पारगम्यता की सामान्य कमी है। यह अंत करने के लिए, हम CDK2 / cyclin के माध्यम से एक अवरोध को नियंत्रण मुक्त E2F1 शोषण विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के आगे के विकास के लिए और अधिक दवा की तरह यौगिकों में इन शक्तिशाली peptidic अवरोधकों को परिवर्तित करने के लिए आदेश में बदलने की रणनीति लागू की गई है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल cyclin नाली की जगह के आवेदन में पूरा हो चुका है कि काम का सार। पहले उदाहरण में, HAKRRLIF के एन टर्मिनल tetrapeptide के लिए दवा की तरह कैपिंग समूह प्रतिस्थापन की पहचान की गई। इसके अलावा इन समूहों में सुधार की जगह के लिए एक अतिरिक्त सत्यापन अध्ययन में जांच की गई। इन अध्ययनों से प्रतिनिधि के परिणाम भी प्रस्तुत कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr’s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.
Materials
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, , Micro pipets, | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT), | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates, | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent, | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter. | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Riferimenti
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