タンパク質 - タンパク質相互作用の阻害剤の開発を通じてREPLACE：アプリケーションの設計と開発非ATP競合CDK阻害剤に
Summary
We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.
Abstract
REPLACEより効果的にタンパク質 – タンパク質相互作用薬（PPI）を対象に開発されたユニークな戦略です。そのような結合部位とその潜在的な薬物標的の大部分を表すための阻害剤の同定のための改良された方法を提供することによって、利用可能な薬物標的の空間を拡張することを目的とします。この論文の主な目的は、計算と合成化学の手法を伴うREPLACE戦略の使用および適用の方法論的な概要を提供することを目的とします。 REPLACEは、抗腫瘍治療薬としての非ATP競合的サイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤の開発への応用を通して例示されます。 CDKはしばしば癌において調節解除されているので、薬剤開発のための重要な標的と考えられています。 S期におけるCDK2 /サイクリンAの阻害は、E2F1の経路を介したp53依存的に癌細胞の選択的アポトーシスを促進することが報告されています。サイクリンバインディンでのタンパク質 – タンパク質相互作用を標的G溝（CBG）は、転写のCDKを超える細胞周期の特異的阻害を可能にする手法です。 CBGは、CDKの基質および腫瘍抑制タンパク質由来のコンセンサス配列によって認識されるモチーフ（CBM）に結合するサイクリンと呼ばれます。 CBMは、以前に十分な活性（RRLIF）を保持ペンタペプチドに切り捨てられ、さらにその後p21Waf（HAKRRIF）からオクタペプチドに最適化されています。一般的に、ペプチドは、細胞透過性ではなく、代謝的に不安定なので、（計算濃縮を通じて部分的リガンドの代替と交換）を交換戦略は以上の薬物のような阻害剤を生成するために適用されています。戦略は、選択的に細胞周期CDK /サイクリン複合体を阻害断片ライゲーション阻害ペプチド（フリップ）の設計から始まります。フリップは上の交換に続いて、N末端（NCAPS）から開始して、反復的に小分子（キャッピング基）のような断片でHAKRRLIF / RRLIFの残基を置換することにより作製しましたC末端。これらの化合物は、抗腫瘍治療薬としての非ATP競合的CDK阻害剤の生成のためのポイントを開始しています。
Introduction
この記事では、それ以上の薬学的に関連する分子にタンパク質-タンパク質相互作用のペプチド性阻害剤を変換するための戦略REPLACE（計算濃縮用いた部分リガンド代替と交換）を適用したケーススタディでは、1〜3に記載されています 。 PPIは、潜在的な薬物標的の豊富なしかしunderexploitedソースを示しているが、既存の方法論は、これらが広くアクセス可能にするために大部分が不十分です。フラグメントベースの設計4、ハイスループットスクリーニング5,6は進歩を提供したステイプルペプチドを含む現在の戦略は、しかし、これらは、多くの場合、効果がありません。その結果、より多くの進歩と、より効率的なアプローチが必要とされます。 REPLACEは、完全に薬物様特性を改善したキナーゼ阻害剤の開発で確認し、抗腫瘍治療薬としてのさらなる開発の可能性を持っているされています。この戦略は、細胞の非ATP阻害剤の開発に例示されていますサイクルのCDKと次のように含む：1）サイクリン結合溝とHAKRRLIF / RRLIFの相互作用の3次元構造情報を取得します。 2）ペプチドの相互作用のための重要な結合決定基を決定します。一つ以上の結合決定基を含むペプチドN末端の3）切り捨て。 4）計算ペプチドの切断部分のための潜在的な小分子の選択肢（部分的リガンド代替、のPLA）の同定とその親ペプチドの重要な相互作用を保持します。 5）のPLAの合成または商業ソーシングは、以前削除されたペプチド残基（複数可）によって占有サブサイトと強く結合すると予測します。 6）固相合成を使用して切断されたペプチドへの最善のPLAの連結を通じてフリップの合成;細胞生存率アッセイにおけるさらなる特徴付けに続いてインビトロ結合または機能的アッセイ（CDK /サイクリンコンテキストで蛍光偏光）におけるフリップの7）テスト。 REPLACE strategの略図Yは、 図1に示されている。この論文では、REPLACE戦略の反復を議論して詳細に説明CDK2 /サイクリンAに適用されます。 CDK類は、直接または間接的に、腫瘍の大部分において調節解除されると考えられているので、適切な癌薬剤標的7と考えられています。 CDKは完全な活性化のためのサイクリンとの関連付けを必要とし、その後、細胞周期の調節に関与する重要な8蛋白質をリン酸化します。 CDKの二つの主要なグループは、細胞周期チェックポイントを制御アイソタイプ[G1 / S（CDK4 /サイクリンD、CDK6 /サイクリンDおよびCDK4 /サイクリンE）、S相（CDK2 /サイクリンA）、およびG2 / M（CDK1 /ありますサイクリンB）]とリン酸化を介したRNAポリメラーゼのレギュレータ（CDK7 /サイクリンH、CDK8 /サイクリンC、CDK9 /サイクリンT）。 E2F1転写因子は、次いでDNAに結合し、遺伝子転写を開始するDPタンパク質と複合体を形成する際に、S期の進行における重要なステップが発生します。 CDK2 /サイクリンAは、E2F1の転写を中和するために必要とされますリン酸化を介し活動によりE2F1-DP複合体およびその後の分解の放出をもたらします。 CDK2 /サイクリンAの阻害は、そのDNAに結合した状態が持続的活性化をもたらすでE2F1を維持すると考えられています。 E2F-1活性の結果として得られるレベルは、したがって、治療戦略を示唆したp53依存性アポトーシスを誘導するために必要な閾値を上回るだろう。無秩序なのp53およびpRb経路に、E2F-1の高レベルは、しばしば、癌細胞及びCDK2 /サイクリンAの阻害を生じる、腫瘍に選択的アポトーシスをもたらすはずであると検証さ癌標的7と考えることができます。
臨床的に研究さCDK阻害剤は、ヒトキノームより大きい500のプロテインキナーゼの中で反応性を横断する主要な高度に保存されたATP結合部位を標的とし、潜在的な効果と毒性9を左右に生じます。別のアプローチは、CBGを介して基板動員を標的とすることによって、非ATP競合阻害でありますサイクリン正の調節サブユニット上に存在し、したがってこれはATP結合部位10,11からはっきりと離れています。 CBGは、主に、サイクリンA、サイクリンDおよびサイクリンE中に存在する疎水性の溝であり、基板および腫瘍抑制に見出されるコンセンサス配列を認識することが示されています。単離されたペプチドとして、サイクリン結合モチーフ（CBM）は、CBGに結合し、細胞周期CDKのキナーゼ活性を阻害することが示されています。 CBMは、オクタペプチド（HAKRRLIF、CDK2 /サイクリンA、IC 50 0.07±0.02μM、CDK4 /サイクリンD、IC 50 0.88±0.34μM）および薬物のための分子量との間の良好な妥協を表すペンタペプチドにさらに切り捨てに最適化されています肖像および効力（RRLIF、CDK2 /サイクリンA、IC 50 1.01±0.17μM、 CDK4 /サイクリンD、IC 50 25.12±2.97μM）12,13。 CBGsはacidiにより架橋された大きな一次と二次小さい疎水性ポケットで構成されC領域は、（Glu220、Glu224およびAsp283を含みます）。 HAKRRLIFの重要な結合決定は、酸性領域とプライマリ親油性部位とLeu6とPhe8の相補性度の高いLys3の、Argを4と引数5の二次疎水性ポケット、イオン対と水素結合を有するAla2の相互作用が含まれます。 Ile7が主ポケットとの最適な接触を可能にするスペーサー残基として作用しながら加えて、多数の水素結合は、ペプチド骨格から寄与しています。 CBGとの結合様式とHAKRRLIFの相互作用は、図2に示されています。
CBM / CBGタンパク質-タンパク質相互作用を標的とすることは、CDK2 /サイクリンA、CDK2 /サイクリンE＆CDK4 /サイクリンDのキナーゼ活性を阻害し、正常細胞を7に影響を与えずに 、これは、癌細胞のE2F1媒介アポトーシスを誘発する必要があります。 CBM由来ペプチドは、細胞周期のCDKの有効な阻害剤であるが、それは、それらの代謝に薬剤として有用である可能性は低いです不安定性と細胞透過性の一般的な不足。この目的のために、我々は、CDK2 /サイクリン阻害を介して調節解除されたE2F1を利用した抗腫瘍治療法のさらなる発展のためのより多くの薬剤様化合物にこれらの強力なペプチド性阻害剤を変換するために、REPLACE戦略を適用しています。以下のプロトコルは、サイクリン溝にREPLACEの適用に完成された作品をまとめたものです。まず第一に、HAKRRLIFのN末端テトラペプチドのための薬剤のようなキャッピング基の置換が同定されました。さらに、これらの群の改善は、REPLACEのための追加の検証試験で検討しました。これらの研究からの代表的な結果も提示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr’s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.
Materials
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, , Micro pipets, | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT), | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates, | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent, | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter. | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Riferimenti
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