Udvikling af inhibitorer af protein-protein interaktioner gennem REPLACE: Ansøgning til design og udvikling Ikke-ATP Konkurrencedygtige CDK hæmmere

Summary

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Abstract

Udskiftning, er en unik strategi udviklet for mere effektivt at målrette protein-protein interaktioner (PPI). Det sigter mod at udvide tilgængelig target narkotika plads ved at give forbedret metode til identifikation af inhibitorer for sådanne bindingssteder, og som repræsenterer størstedelen af ​​de potentielle lægemiddelkandidater. Hovedformålet med dette oplæg er at give en metodisk overblik over brugen og anvendelsen af ​​UDSKIFT strategi, som involverer beregningsmæssige og syntetiske kemi tilgange. REPLACE er eksemplificeret gennem sin ansøgning til udvikling af ikke-ATP konkurrencemæssig cyclinafhængige kinaser (CDK) inhibitorer som anti-tumor lægemidler. CDK'er ofte dereguleret i kræft og dermed betragtes som vigtige mål for lægemiddeludvikling. Inhibering af CDK2 / cyclin A i S-fasen er blevet rapporteret at fremme selektiv apoptose af cancerceller i en p53 uafhængigt gennem E2F1 pathway. Målretning interaktionen protein-protein ved binding en cycling rille (CBG) er en tilgang, som vil tillade den specifikke hæmning af cellecyklus i transkriptionelle CDK'er. CBG genkendes af en konsensussekvens afledt af CDK substrater og tumorsuppressorproteiner betegnes cyclin-bindende motiv (CBM). CBM er tidligere blevet optimeret til et octapeptid fra p21Waf (HAKRRIF) og derefter yderligere afkortet til en pentapeptid fastholde tilstrækkelig aktivitet (RRLIF). Peptider generelt ikke er cellepermeable, er metabolisk ustabile og derfor erstatte (udskiftning med delvis ligand Alternativer gennem Computational Enrichment) strategi er blevet anvendt med henblik på at generere flere lægemiddellignende inhibitorer. Strategien begynder med udformningen af ​​fragment ligeret inhibitoriske peptider (flips), der selektivt inhiberer cellecyklus CDK / cyclin-komplekser. Flips blev genereret ved iterativt at erstatte rester af HAKRRLIF / RRLIF med fragment som små molekyler (capping grupper), startende fra N-terminalen (Ncaps), efterfulgt af udskiftning påC-terminalen. Disse forbindelser er udgangspunkter for generering af ikke-ATP konkurrencedygtige CDK-inhibitorer som anti-tumor lægemidler.

Introduction

I denne artikel er et casestudie af at anvende den REPLACE (udskiftning med delvis ligand alternativer ved hjælp af beregningsmæssige berigelse) strategi til at konvertere peptidiske inhibitorer af protein-protein interaktioner i flere farmaceutisk relevante molekyler beskrevet ^1-3. Mens PPI repræsenterer en rig, men underudnyttet kilde til potentielle mål drug, eksisterende metoder er stort set utilstrækkelige til at gøre dem bredt tilgængelige. Nuværende strategier, herunder fragment baseret design ^4, high-throughput screening ⁵ og hæftede peptider ⁶ har givet fremskridt, men disse er i mange tilfælde ineffektive. Som følge heraf er flere fremskridt og mere effektive metoder påkrævet. REPLACE er fuldt valideret i udviklingen af ​​kinaseinhibitorer, der har forbedret lægemiddel-lignende egenskaber, og som har potentiale for yderligere udvikling som anti-tumor lægemidler. Denne strategi er eksemplificeret i udviklingen af ​​ikke-ATP inhibitorer af cellecyklus CDK'er og involverer som følger: 1) at opnå 3D strukturel information om samspillet mellem HAKRRLIF / RRLIF med cyklin bindende rille; 2) at bestemme de vigtige bindende determinanter for peptid-interaktion; 3) trunkering af peptidet N-terminus indeholder en eller flere bindende determinanter; 4) beregningsmæssige identifikation af potentielle små molekyler alternativer (delvise ligand alternativer, PLAS) for den trunkerede del af peptidet, og som bevarer vigtigste vekselvirkninger moderselskabets peptid; 5) syntese eller kommerciel sourcing af PLA'er forudsagt at binde ivrigt med sub webstedet tidligere besat af den slettede peptidresten (r); 6) Syntese af bladrer ligering af de bedste PLA'er til den trunkerede peptid anvendelse af fastfasesyntese; 7) testning af flips i en di vitro-binding eller funktionelt assay (fluorescenspolarisering i CDK / cyclin kontekst) efterfulgt af yderligere karakterisering i en celleviabilitetstest. En skematisk repræsentation af UDSKIFT strategy er vist i figur 1. I denne artikel, er gentagelser af REPLACE strategi diskuteret og ansøgningen til CDK2 / cyclin A beskrevet i detaljer. CDKer menes at være direkte eller indirekte dereguleret i størstedelen af tumorer, og anses derfor for passende cancer drug mål ^7. CDKer kræver samarbejde med cycliner for fuld aktivering og efterfølgende phosphorylerer vigtige proteiner involveret i reguleringen cellecyklus ^8. De to store grupper af CDK'er er isotyper der styrer cellecykluskontrolpunkter [G1 / S (CDK4 / cyclin D, CDK6 / cyclin D og CDK4 / cyclin E), S-fasen (CDK2 / cyclin A) og G2 / M (CDK1 / cyklin B)] og regulatorer af RNA-polymerase gennem phosphorylering (CDK7 / cyklin H, CDK8 / cyklin C, CDK9 / cyklin T). Et vigtigt skridt i S-fase progression opstår, når E2F1 transkriptionsfaktoren danner et kompleks med DP-proteinet, som derefter binder til DNA og initierer gentranskription. CDK2 / cyclin A er påkrævet for at neutralisere E2F1 transkriptionelaktivitet gennem fosforylering hvilket fører til frigivelse af E2F1-DP-komplekset og efterfølgende nedbrydning. Inhibering af CDK2 / cyclin A menes at opretholde E2F1 i DNA bundne tilstand fører til vedvarende aktivering. Den resulterende niveau af E2F-1-aktivitet vil overgå tærsklen kræves for at inducere p53 uafhængig apoptose derfor tyder på en terapeutisk strategi. På grund af dereguleret p53 og pRb veje, høje niveauer af E2F-1 ofte forekommer i cancerceller og inhibering af CDK2 / cyclin A bør føre til selektiv apoptose i tumorer og kan betragtes som en valideret cancer-target ^7.

Klinisk undersøgte CDK-inhibitorer målrette stærkt konserverede ATP-bindingssted fører til krydsreaktivitet blandt de mere end 500 proteinkinaser i den menneskelige kinome og potentielt giver anledning til bivirkninger og toksicitet ^9. En alternativ tilgang er ikke-ATP kompetitiv hæmning ved at målrette substrat rekruttering gennem CBGstede på cyclin positive regulatoriske underenhed, og som adskiller sig derfor og fjernt fra ATP-bindingssted ^10,11. CBG er primært en hydrofob rille stede i cyclin A, cyclin D og cyclin E og har vist sig at genkende en konsensus sekvens fundet i substrater og tumorsuppressorer. Som et isoleret peptid, cyclin-bindende motiv (CBM) binder til CBG og har vist sig at inhibere kinaseaktiviteten af ​​cellecyklussen CDK'er. CBM er optimeret til et octapeptid (HAKRRLIF, CDK2 / cyclin A _IC50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cyclin D, _IC50 0,88 ± 0,34 uM), og desuden trunkeret til en pentapeptid repræsenterer et godt kompromis mellem molekylvægt for lægemiddel- lighed og styrke (RRLIF, CDK2 / cyklin A _IC50 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cyclin D, IC ₅₀ 25,12 ± 2,97 uM) ^12,13. De CBGs består af en stor primær og mindre sekundære hydrofobe lomme, som er bro af en ACIDIc-regionen (inkluderer Glu220, Glu224 og Asp283). De vigtigste bindende determinanter for HAKRRLIF omfatter samspillet mellem Ala2 de sekundære hydrofobe lomme, ion parring og hydrogenbindinger af Lys3, Arg 4 og Arg5 med det sure regionen og en høj grad af komplementaritet mellem Leu6 og pHE8 med det primære lipofile site. Desuden er mange hydrogenbindinger bidraget fra peptidet rygraden, mens Ile7 fungerer som en spacer-rest giver optimal kontakt med det primære lomme. Bindingen mode og interaktioner af HAKRRLIF med CBG er vist i figur 2.

Målretning CBM / CBG protein-protein interaktion vil hæmme kinase aktivitet af CDK2 / cyklin A, CDK2 / cyklin E & CDK4 / cyclin D og det bør udløse E2F1 medieret apoptose af cancerceller uden at påvirke normale celler ^7. Selv CBM afledte peptider er effektive inhibitorer af cellecyklus CDK'er, er det usandsynligt, at de vil være egnede som lægemidler på grund af deres metaboliskeustabilitet og generel mangel på cellepermeabilitet. Til dette formål har vi anvendt den UDSKIFT strategi for at konvertere disse potente peptidiske inhibitorer i flere narkotika-lignende stoffer til yderligere udvikling af anti-tumor terapi udnytter dereguleret E2F1 gennem CDK2 / cyklin A hæmning. Følgende protokol sammenfatter arbejde, der er gennemført i forbindelse med anvendelsen af ​​REPLACE til cyklin rille. I første omgang blev identificeret narkotika-lignende cappinggruppe erstatninger for den N-terminale tetrapeptid af HAKRRLIF. Desuden forbedringer på disse grupper blev undersøgt i en yderligere validering undersøgelse for REPLACE. Repræsentative resultater fra disse undersøgelser er også præsenteret.

Protocol

1. Computational Identifikation af potentielle lille molekyle Capping Grupper Bemærk: I princippet kan en række docking eller farmakofor søgemetoder anvendes til at forudsige potentielle capping grupper. Hovedformålet med beregningsmæssige undersøgelser i REPLACE er at identificere små molekyler, der bevarer de funktioner og interaktioner af aminosyrerne, der er substitueret. Validering af LigandFit docking-protokol 14 Bemærk: …

Representative Results

Samspillet mellem HAKRRLIF med cyclin rillen er vist i figur 2. De peptidrester, der repræsenterer de vigtigste bindingsdeterminanterne omfatter Ala2, Arg4, Leu6 og pHE8 med andre restprodukter stille mindre bidrag 12,13,18. I dette tilfælde undersøgelse er blevet udnyttet den UDSKIFT strategi for at finde fragment alternativer for rester i den N-terminale tetrapeptid af HAKRRLIF, primært efterligner samspillet mellem Ala2 og Arg4. Et bibliotek af potentielle NCAP fragmenter (tabe…

Discussion

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts¹⁹. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability²⁰. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…

Materials

Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, ,  Micro pipets,	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70c freezer	Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector  fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates,	Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines	ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,  MTT reagent,	Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer	VWR
-70c freezer	Revco (Ultima II)
Incubator	Thermo electron corporation
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Refrigerator 4-8C	Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.	Beckman Coulter, Brea, CA