एक छोटी मात्रा Bioassay जल-पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) Fluorometry का प्रयोग बैक्टीरियल / Phytoplankton सह संस्कृति का आकलन करने के लिए
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
संस्कृति प्रयोग 1-7 भर subsampled जा सकता है कि इतने सूक्ष्म शैवाल की प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए पारंपरिक तरीकों, संस्कृति की बड़ी मात्रा में (5 एल के लिए 20 मिलीग्राम) कार्यरत है। बड़ी मात्रा के subsampling कई कारणों के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है: 1) यह कुल मात्रा और सतह के क्षेत्र में परिवर्तन का कारण बनता है: प्रयोग के दौरान संस्कृति की मात्रा के अनुपात; 2) छद्म प्रतिकृति (यानी, एक ही इलाज कुप्पी 8 से नमूने) अक्सर बल्कि सच प्रतिकृति (दोहराने के उपचार से यानी, नमूना) की तुलना में कार्यरत है दोहराने; 3) प्रयोग की अवधि कुल मात्रा द्वारा सीमित है; और 4) axenic संस्कृतियों या सामान्य बैक्टीरिया microbiota संदूषण सामान्यतः subsampling के दौरान होता है के रूप में लंबी अवधि के प्रयोगों के दौरान बनाए रखने के लिए मुश्किल है।
microtiter प्लेट के उपयोग के भीतर अप करने के लिए 48 अलग-अलग उपचार के साथ एक मिलीलीटर संस्कृति से प्रत्येक के लिए प्रयोग की जाने वाली संस्करणों को दोहराने में सक्षम बनाता हैएक 12.65 एक्स 8.5 एक्स 2.2 सेमी की थाली, जिससे प्रयोगात्मक मात्रा कम है और किसी भी उपचार subsampling बिना व्यापक नकल के लिए अनुमति देता है। 9-11 स्क्रीनिंग जीवाणु-काई के सह संस्कृतियों, काई के शरीर क्रिया विज्ञान परीक्षण, और विष: इसके अतिरिक्त, इस तकनीक प्रयोगात्मक सहित प्रारूपों के एक किस्म फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक alga, जीवाणु और / या सह संस्कृतियों के साथ व्यक्तिगत कुओं तक ही सीमित सहित कई प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के लिए नमूना है, लेकिन नहीं किया जा सकता है: जल पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) fluorometry, माइक्रोस्कोपी, बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) मायने रखता है और प्रवाह cytometry। microtiter प्लेट स्वरूप और पानी पीएएम fluorometry के संयोजन प्रकाश रासायनिक उपज और नमूने, उच्च reproducibility के बीच कम परिवर्तनशीलता के साथ अन्य प्रकाश रासायनिक मापदंडों के एकाधिक तेजी से मापन के लिए अनुमति देता है और एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर एक काबोइ या शंक्वाकार फ्लास्क subsampling के कई नुकसान से बचा जाता है ।
Introduction
Phytoplankton फिजियोलॉजी पारंपरिक रूप से शंक्वाकार बोतल में 20 मिलीलीटर से carboys 1-7 में 5 एल को लेकर मेसो-पैमाने पर प्रयोग में अध्ययन किया गया है। हर समय बिंदु के लिए दोहराने के नमूनों का त्याग एक असहनीय प्रयोगात्मक सेटअप बनाता है के रूप में यह प्रायोगिक पैमाने पर, प्रयोगात्मक निगरानी के लिए subsampling की आवश्यकता है।
कम या बड़ी मात्रा से subsampling और छद्म प्रतिकृति की सीमाओं को समाप्त होगा काई के शरीर क्रिया विज्ञान के प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक मात्रा miniaturizing द्वारा एक ही दीन का इनक्यूबेटर अंतरिक्ष का उपयोग करते समय क्षमता स्वतंत्र प्रयोगों की संख्या में वृद्धि करने के लिए। एक microtiter प्लेट स्वरूप प्रयोगात्मक चर परिस्थितियों में शैवाल जोड़ तोड़ के लिए एक 1 मिलीलीटर संस्कृति मात्रा का उपयोग काई bioassays के लिए विकसित किया गया है। इस छोटे प्रयोगात्मक मात्रा प्रतिकृति की संख्या में वृद्धि की जानी करने के लिए अनुमति देता है, की वजह से दोहराने के नमूने और के बीच एक कम परिवर्तनशीलता के लिए प्रयोगात्मक reproducibility के बढ़ जाती है(चित्रा 2) 12 से 140 दिनों के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण (यानी, axenic काई संस्कृतियों) को बनाए रखते हुए प्रयोगों, और सच प्रतिकृति की अनुमति देता है।
इस microtiter प्लेट स्वरूप आसानी से इस तरह के रूप में, प्रयोगात्मक सवालों की एक किस्म के लिए अनुकूलित है: एक जीवाणु इसकी काई के मेजबान के साथ एक, सहजीवी तटस्थ या रोगजनक बातचीत के लिए है? एक alga के लिए एक यौगिक उत्तेजक के अलावा या विषैला होता है? इन और अन्य सवालों के इस नए प्रारूप 9-11 का उपयोग कर एक तेजी से उच्च throughput ढंग से संबोधित किया जा सकता है।
एक 48 अच्छी तरह से microtiter संस्कृति की थाली प्रत्येक 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से एक ही समय बिंदु पर नमूना है कि एक स्वतंत्र प्रयोगात्मक स्थापना होने के लिए अनुमति देता है। विभिन्न मापदंडों सहित इस 1 मिलीलीटर मात्रा से नमूना है, लेकिन सीमित नहीं किया जा सकता है: जल पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) fluorometry (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) 1 का उपयोग क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति और प्रकाश रासायनिक मापदंडों3। जल-पीएएम fluorometry शैवाल 13 के साथ प्रदर्शन प्रयोगों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तेजी से और गैर इनवेसिव तकनीक है। 14,15 (जल-पीएएम के लिए 4 मिलीलीटर मात्रा – – एक से 2 मध्यम में पतला संस्कृति के 300 μl 150) यह एक छोटी सी संस्कृति मात्रा से संश्लेषक दक्षता और PSII स्वास्थ्य की माप की अनुमति देता है। जल-पीएएम fluorometry के अलावा, इस स्थापना सहित अन्य मानकों की एक किस्म को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं: शैवाल कोशिकाओं और काई सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन से जुड़ी बैक्टीरिया कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोपी; यूनिट (CFU) की गिनती के गठन बैक्टीरियल कॉलोनी; और काई सेल मायने रखता है और पहचान के उप-जनसंख्या के लिए प्रवाह cytometry।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक छोटी प्रारूप में algal विकास।
एक प्रयोग के भीतर प्रतिकृति बढ़ा जा करने के लिए एक microtiter प्लेट में एक 1 मिलीलीटर संस्कृति मात्रा करने के लिए काई संस्कृतियों के miniaturization अनुमति देता है। यह शैवाल एक प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
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