Un ensayo biológico Volumen pequeños para evaluar bacteriana / fitoplancton Co-cultura Usando AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (AGUA-PAM) Fluorometría
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Los métodos convencionales para la manipulación experimental de microalgas han empleado grandes volúmenes de cultivo (20 ml a 5 L), de manera que el cultivo puede dividirse en submuestras durante todo el experimento 1-7. El submuestreo de grandes volúmenes puede ser problemático por varias razones: 1) que causa la variación en el volumen total y el área superficial: relación de volumen de la cultura durante el experimento; 2) pseudo-replicación (es decir, muestras repetidas de un mismo frasco de tratamiento 8) a menudo se emplea en lugar de repeticiones verdaderas (es decir, el muestreo de los tratamientos replicados); 3) la duración del experimento es limitada por el volumen total; y 4) los cultivos axénicos o la microbiota bacteriana habitual son difíciles de mantener durante los experimentos a largo plazo ya que la contaminación ocurre comúnmente durante el submuestreo.
El uso de placas de microtitulación permite volúmenes de cultivo 1 ml de ser utilizados para cada replicar, con hasta 48 tratamientos separados dentro deuna placa de 12,65 cm x 8,5 x 2,2, disminuyendo de ese modo el volumen experimental y permitiendo la replicación extensa sin submuestreo cualquier tratamiento. Además, esta técnica puede ser modificada para adaptarse a una variedad de formatos experimentales, incluyendo: bacteriana-co-cultivos de algas, pruebas de fisiología de algas, y la toxina de detección 9-11. Pozos individuales con un alga, bacteria y / o co-cultivos pueden ser degustados por numerosos procedimientos de laboratorio, incluyendo, pero no limitado a: AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (AGUA-PAM) fluorometría, microscopía, unidad de colonia de bacterias (UFC) condes y citometría de flujo. La combinación del formato de placa de microtitulación y agua-PAM fluorometría permite múltiples mediciones rápidas de rendimiento fotoquímico y otros parámetros fotoquímicos con baja variabilidad entre las muestras, alta reproducibilidad y evita las muchas trampas de submuestreo una bombona o matraz cónico en el transcurso de un experimento .
Introduction
Fisiología fitoplancton tradicionalmente se ha estudiado en experimentos meso-escala que van desde 20 ml en matraces cónicos de 5 L en bombonas 1-7. Esta escala experimental requiere submuestreo para el seguimiento experimental, como sacrificar muestras repetidas para cada momento crea un montaje experimental inmanejable.
La capacidad de aumentar el número de experimentos independientes, mientras que utilizando el mismo espacio de la incubadora diurna por miniaturizar el volumen experimental para experimentos de fisiología de algas ayuden a reducir o eliminar las limitaciones de submuestreo y pseudo-replicación de grandes volúmenes. Un formato de placa de microtitulación se ha desarrollado para bioensayos de algas utilizando un volumen de cultivo 1 ml para manipular experimentalmente algas en condiciones variables. Este pequeño volumen experimental permite el número de repeticiones que se incremente, aumenta la reproducibilidad experimental debido a una variabilidad disminuido entre muestras replicadas yexperimentos, y permite cierto replicación manteniendo controles experimentales (es decir, cultivos de algas axénicos) de 140 días (Figura 2) 12.
Este formato de placa de microtitulación se adapta fácilmente para una variedad de preguntas experimentales, tales como: una bacteria no tiene una interacción simbiótica, neutral o patógena con su anfitrión de algas? Es la adición de un compuesto estimulante o tóxicas para un alga? Estas y otras cuestiones se pueden abordar en una rápida forma de alto rendimiento utilizando este nuevo formato 9-11.
Una placa de cultivo de microtitulación de 48 pocillos permite que cada 1 ml bien para ser un montaje experimental independiente que se muestrea en un único punto de tiempo. Varios parámetros se pueden tomar de este volumen 1 ml incluyendo, pero no limitado a: fluorescencia de la clorofila y los parámetros fotoquímicos usando-Amplitud Modulada AGUA-Pulse (AGUA-PAM) fluorometría (ver Materiales y mesa Equipo) 13. Fluorometría AGUA-PAM es una técnica rápida y no invasiva que se puede utilizar para monitorear experimentos realizados con algas 13. Permite la medición de la eficiencia fotosintética y la salud PSII de un volumen de cultivo pequeño (150 a 300 l de cultivo diluido en medio a un 2 – volumen 4 ml de AGUA-PAM) 14,15. Además de fluorometría AGUA-PAM, esta configuración se puede utilizar para medir una variedad de otros parámetros incluyendo, pero no limitado a: la microscopía para visualizar las bacterias adheridas a las células de algas y los cambios en la morfología de células de algas; colonia de bacterias que forman el recuento (ufc) de la unidad; y citometría de flujo para el recuento de células de algas y subpoblaciones de identificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crecimiento de las algas en un formato miniaturizado.
La miniaturización de los cultivos de algas a un volumen de cultivo 1 ml en una placa de microtitulación permite la replicación dentro de un experimento para ser aumentado. Es importante asegurar la alga es saludable durante un experimento; realizar una curva de crecimiento (Figura 2), utilizando el formato de placa de microtitulación para evaluar diversos medios de algas, para asegurar que se cumplan los requerimientos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
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