A Small Volume Bioassay um bakterielle / Phytoplankton Co-Kultur Bewerten Sie mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Herkömmliche Verfahren für die experimentelle Manipulation von Mikroalgen haben große Volumen der Kultur (20 ml bis 5 l) verwendet, so daß die Kultur kann während des ganzen Versuchs 1-7 unterabgetastet werden. Subsampling großer Mengen kann aus verschiedenen Gründen problematisch: 1) es Veränderung der Gesamtmenge und dem Oberflächenbereich bewirkt: Volumenverhältnis der Kultur während des Experiments; 2) pseudo-Replikation (dh Parallelproben aus der gleichen Behandlung Kolben 8) wird häufig nicht wahr Wiederholungen (dh Probenahme von Wiederholungsbehandlungen) eingesetzt wird; 3) die Dauer des Experiments durch das Gesamtvolumen begrenzt ist; und 4) axenische Kulturen oder die übliche bakterielle Mikroflora sind schwierig während der Langzeitversuche beizubehalten als Verunreinigung häufig während Unterabtasten auftritt.
Die Verwendung von Mikrotiterplatten können 1 ml Kulturvolumen für jede verwendet werden repliziert, mit bis zu 48 separaten Behandlungen innerhalbein 12,65 x 8,5 x 2,2 cm Platte, wodurch der experimentellen Volumen verringert und ermöglicht so ein umfassendes Replikation ohne Unterabtastung eine Behandlung. Zusätzlich kann diese Technik modifiziert, um eine Vielzahl von Versuchsformate einschließlich passen: bakterielle Algen Kokulturen, Algen Physiologie Tests und Toxinscreening 9-11. Einzelne Vertiefungen mit einer Alge, Bakterie und / oder Co-Kulturen können für zahlreiche Laborverfahren einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Wasser-Puls-Amplitudenmoduliertes (WATER-PAM) Fluorometrie, Mikroskopie, bakterielle Kolonie bildenden Einheit (cfu) zählt und Durchflusszytometrie. Die Kombination aus dem Mikrotiterplattenformat und WASSER-PAM Fluorometrie ermöglicht mehrere schnelle Messungen der photochemischen Ausbeuten und andere photochemische Parameter mit geringer Variabilität zwischen den Proben, hohe Reproduzierbarkeit und vermeidet die vielen Fallstricke der Unterabtastung eine Glasballon oder Erlenmeyerkolben im Verlauf eines Experiments .
Introduction
Phytoplankton Physiologie ist traditionell in mesoskaligen Experimente im Bereich von 20 ml in Erlenmeyerkolben bis 5 l in Glasballons 1-7 untersucht. Diese experimentellen Maßstab erfordert Abtastung für experimentelle Beobachtung, da opfern Parallelproben für jeden Zeitpunkt erzeugt eine unüberschaubare Versuchsaufbau.
Die Fähigkeit, die Anzahl der unabhängigen Versuche erhöhen, während die gleiche Tages Inkubator Raum durch Miniaturisieren des Versuchsvolumens für Algen Physiologie Experimente verringern oder beseitigen die Grenzen der Unterabtastung und Pseudo-Replikation aus großen Volumina. Ein Mikrotiterplattenformat für Algen Bioassays unter Verwendung einer 1 ml Kulturvolumen zum experimentellen Manipulation Algen in verschiedenen Bedingungen entwickelt. Diese kleinen Versuchsvolumen ermöglicht die Anzahl der Wiederholungen erhöht wird, erhöht experimentelle Reproduzierbarkeit aufgrund einer verringerten Variabilität zwischen Wiederholungsproben undExperimente und ermöglicht echte Replikation während experimentelle Kontrollen (dh axenischen Algenkulturen) 140 Tage (Figur 2) 12.
Diese Mikrotiterplattenformat wird leicht für eine Vielzahl von experimentellen Fragen angepasst, wie: Bietet ein Bakterium haben eine symbiotische, neutral oder pathogenen Wechselwirkung mit seinem Algen Host? Ist die Zugabe einer Verbindung zu stimulieren oder toxisch einer Alge? Diese und andere Fragen können in einer schnellen Hochdurchsatz-Art und Weise mit diesem neuen Format 9-11 angesprochen werden.
Ein 48-Loch-Mikrotiterplatten Kulturplatte ermöglicht je 1 ml und eine unabhängige Versuchsanordnung, die zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt abgetastet werden. Verschiedene Parameter können von diesem 1 ml Volumen einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Chlorophyllfluoreszenz und photochemische Parameter mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie (siehe Materialien und Geräte-Tabelle) 13. WATER-PAM-Fluorometrie ist eine schnelle und nicht-invasive Technik, die verwendet werden können, um Versuche mit Algen 13 ausgeführt überwachen. Es erlaubt die Messung der photosynthetischen Effizienz und PSII Gesundheit von einem kleinen Kulturvolumen (150 bis 300 & mgr; l der Kultur in Medium zu einer 2 verdünnt – 4 ml Volumen für WATER-PAM) 14,15. Neben Wasser-PAM Fluorometrie kann dieser Aufbau verwendet werden, um eine Vielzahl von weiteren Parametern zu messen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Mikroskopie, um die Bakterien zu Algenzellen und Veränderungen in der Algenzellmorphologie befestigt visualisieren; bakterielle koloniebildende Einheit (CFU) zählt; und Durchflusszytometrie für Algenzellzahlen und die Ermittlung Subpopulationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algenwachstum in Miniaturformat.
Die Miniaturisierung der Algenkulturen zu einer 1 ml Kulturvolumen in einer Mikrotiterplatte ermöglicht die Replikation innerhalb eines Experiments erhöht werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Alge ist im gesamten Experiment gesund; führen eine Wachstumskurve (Figur 2), unter Verwendung des Mikrotiterplatten-Format, um verschiedene Algenmittel daraufhin überprüfen, den Nahrungsbedarf der Alge erfüllt sind. Darüber hinaus kann …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
