Een klein volume Bioassay om Bacteriële / Fytoplankton Co-cultuur Beoordeel met behulp van water-Pulse-amplitudegemoduleerde (WATER-PAM) fluorometrie
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Gebruikelijke werkwijzen voor experimentele manipulatie van microalgen grote hoeveelheid voedingsoplossing (20 ml tot 5 l) toegepast, waardoor de kweek gedurende het experiment 1-7 worden subsampled. Subbemonstering grote volumes problematisch om verschillende redenen: 1) het veroorzaakt variatie in het totale volume en het oppervlak: volume verhouding van de cultuur tijdens de proef; 2) pseudo-replicatie (dwz identieke monsters van dezelfde behandeling kolf 8) wordt vaak gebruikt in plaats van echte duplo (dwz bemonstering van herhaalde behandelingen); 3) de duur van het experiment is beperkt door het totale volume; en 4) axenic culturen of de gebruikelijke bacteriële microbiota moeilijk te handhaven gedurende langdurige experimenten verontreiniging frequent voorkomend steekproef van.
Het gebruik van microtiterplaten staat stelt 1 ml kweek volumes worden gebruikt voor elke repliceren, met tot 48 afzonderlijke behandelingen binneneen 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plaat, waardoor de experimentele volume afneemt en waardoor voor uitgebreide replicatie zonder steekproef van enige behandeling. Daarnaast kan deze techniek worden gemodificeerd om een verscheidenheid van experimentele formaten zoals fit: bacteriën en algen co-culturen algen fysiologie tests en toxine screening 9-11. Individuele putjes met een alg, bacterie en / of co-culturen worden bemonsterd voor talrijke laboratoriumprocedures waaronder, maar niet beperkt tot: WATER-Pulse Amplitude-gemoduleerde (WATER-PAM) fluorometrie, microscopie, bacteriële kolonievormende eenheid (CFU) tellingen en flow cytometrie. De combinatie van de microtiterplaat formaat en WATER-PAM fluorometrie zorgt voor meerdere snelle metingen van fotochemische opbrengst en andere fotochemische parameters met een lage variabiliteit tussen de monsters, hoge reproduceerbaarheid en vermijdt de vele valkuilen van de steekproef van een mandfles of erlenmeyer in de loop van een experiment .
Introduction
Fytoplankton fysiologie is van oudsher bestudeerd in meso-schaal experimenten gaande van 20 ml in erlenmeyers tot 5 L in mandeflessen 1-7. Deze experimentele schaal vereist subsampling voor experimentele monitoring, zoals offeren identieke monsters voor elk tijdstip creëert een onbeheersbare experimentele opstelling.
De mogelijkheid om het aantal onafhankelijke experimenten vergroten en met dezelfde dagelijkse incubatorruimte door miniaturiseren experimentele volume algen fysiologie experimenten zal verminderen of elimineren de beperkingen van subsampling en pseudo-replicatie van grote volumes. Een microtiterplaat formaat werd ontwikkeld voor algen bioassays met een 1 ml kweek volume experimenteel manipuleren algen in wisselende omstandigheden. Dit kleine experimentele volume maakt het aantal herhalingen te verhogen, verhoogt experimentele reproduceerbaarheid door een verminderde variabiliteit tussen analysemonsters enexperimenten, en maakt waar replicatie behoud experimentele controles (dwz axenic algenculturen) voor 140 dagen (figuur 2) 12.
Deze microtiterplaatformaat geeft ruimte voor verschillende experimentele vragen als: is een bacterie een symbiotische, neutrale of pathogene interactie met algen host? Is de toevoeging van een verbinding stimulerende of toxisch een alg? Deze en andere vragen kunnen worden gericht op een snelle high-throughput manier gebruik van dit nieuwe formaat 9-11.
Een 48-well microtiter plaat cultuur kan elk 1 ml en een onafhankelijke experimentele opstelling die wordt bemonsterd op één tijdpunt zijn. Verscheidene parameters kunnen worden bemonsterd uit dit volume 1 ml waaronder, maar niet beperkt tot: chlorofylfluorescentie en fotochemische parameters met WATER-Pulse-amplitudegemoduleerde (WATER-PAM) fluorometrie (zie Materialen en uitrusting tabel) 13. WATER-PAM fluorometrie is een snelle en niet-invasieve techniek die kan worden gebruikt voor experimenten uitgevoerd met algen 13 volgen. Het laat meten van fotosynthetische efficiëntie en PSII de gezondheid van een kleine cultuur volume (150-300 ul van cultuur verdund in middelgrote tot een 2-4 ml volume voor WATER-PAM) 14,15. Naast WATER-PAM fluorometrie, kan deze opstelling worden gebruikt om een verscheidenheid van andere parameters zoals meten, maar niet beperkt tot: microscopie om de bacteriën aan algen cellen en veranderingen in de algen celmorfologie visualiseren; bacteriële kolonievormende eenheid (cfu) tellingen; en flowcytometrie voor algen cellen en het identificeren van subpopulaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algengroei in een geminiaturiseerde format.
De miniaturisatie algenculturen een 1 ml cultuurvolume in een microtiterplaat maakt de replicatie in een experiment te verhogen. Het is van belang de alg gezond gedurende een experiment; voer een groeicurve (figuur 2) met de microtiterplaat formaat naar verschillende media algen beoordelen, te zorgen voor de voedingsbehoeften van de alg wordt voldaan. Bovendien kan het belangrijk zijn om de dagelijkse cyclus (licht en donker periodes)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
