Et lille volumen Bioassay at Vurdere Bakteriel / Fytoplankton Co-kultur ved hjælp af vand-Pulse-amplitudemodulerede (vand-PAM) fluorometri
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Konventionelle metoder til eksperimentel manipulation af mikroalger har anvendt store mængder af kultur (20 ml til 5 L), således at kulturen kan subsampled hele eksperimentet 1-7. Undersampling af store mængder kan være problematisk af flere årsager: 1) det forårsager variation i den samlede mængde og overfladeareal: volumen-forholdet af kulturen under eksperimentet; 2) pseudo-replikation (dvs. replikere prøver fra den samme behandling kolbe 8) er ofte ansat i stedet for sande gentagelser (dvs. prøveudtagning fra gentagne behandlinger); 3) varigheden af forsøget er begrænset af det totale volumen; og 4) Axeniske kulturer eller den sædvanlige bakterielle mikrobiota er vanskelige at opretholde i langvarige forsøg som forurening almindeligvis forekommer under delstikprøver.
Brugen af mikrotiterplader giver 1 ml mængder kultur, der skal anvendes til hver kopiere, med op til 48 særskilte behandling indenen 12,65 x 8.5 x 2.2 cm plade, den eksperimentelle volumen dermed mindske og giver mulighed for omfattende replikation uden delstikprøver nogen behandling. Derudover kan denne teknik være modificeret til at passe til en række eksperimentelle formater, herunder: bakteriel-algernes co-kulturer, alger fysiologi tests og toksin screening 9-11. Kan udtages prøver individuelle brønde med en alge, bakterie og / eller co-kulturer for mange laboratorieprocedurer, herunder, men ikke begrænset til: WATER-Pulse-amplitudemodulerede (vand-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteriel kolonidannende enhed (CFU) tæller og flowcytometri. Kombinationen af mikrotiterpladeformat og vand-PAM fluorometri giver mulighed for flere hurtige målinger af fotokemisk udbytte og andre fotokemiske parametre med lav variabilitet mellem prøver, høj reproducerbarhed og undgår de mange faldgruber subsampling en ballon eller konisk kolbe i løbet af et eksperiment .
Introduction
Fytoplankton fysiologi har traditionelt været undersøgt i meso-skala forsøg fra 20 ml i koniske kolber til 5 L i dunke 1-7. Denne eksperimentelle skala kræver subsampling for eksperimentel overvågning, som at ofre, der udtages for hvert tidspunkt skaber en uoverskuelig forsøgsopstilling.
Evnen til at øge antallet af uafhængige forsøg, mens du bruger den samme døgnets inkubator plads ved miniaturisering den eksperimentelle volumen for algernes fysiologi eksperimenter vil reducere eller fjerne de begrænsninger af undersampling og pseudo-replikation fra store mængder. En mikrotiterpladeformat er udviklet til alger bioassays under anvendelse af en 1 ml kultur volumen for eksperimentelt manipulere alger i variable forhold. Denne lille eksperimenterende volumen giver mulighed for antallet af gentagelser øges, øger eksperimentel reproducerbarhed på grund af en nedsat variabilitet mellem udtages ogforsøg, og giver ægte replikation samtidig opretholde eksperimentelle kontroller (dvs. Axeniske algekulturer) for 140 dage (figur 2) 12.
Denne mikrotiterpladeformat kan nemt tilpasses til en række eksperimentelle spørgsmål, såsom: betyder en bakterie har et symbiotisk, neutral eller patogen interaktion med alger vært? Er tilsætning af en forbindelse til at stimulere eller giftige for en alge? Disse og andre spørgsmål kan behandles i en hurtig high-throughput måde under anvendelse af dette nye format 9-11.
En 48-brønds mikrotiterplade dyrkningsplade tillader hver 1 ml godt at være en uafhængig forsøgsopstilling, der er samplet ved en enkelt gang-point. Kan udtages prøver forskellige parametre fra denne 1 ml volumen, herunder, men ikke begrænset til: klorofylfluorescens og fotokemiske parametre ved hjælp af vand-Pulse-amplitudemodulerede (vand-PAM) fluorometri (se materialer og udstyr tabel) 13. VAND PAM fluorometri er en hurtig og ikke-invasiv teknik, der kan anvendes til at overvåge eksperimenter udført med alger 13. Det giver mulighed for måling af fotosyntetiske effektivitet og PSII sundhed fra en lille kultur volumen (150-300 pi kultur fortyndet i medium til en 2 – 4 ml volumen for VAND PAM) 14,15. Ud over vand-PAM fluorometri, kan denne opsætning anvendes til at måle en række andre parametre, herunder, men ikke begrænset til: mikroskopi at visualisere bakterierne knyttet til algeceller og ændringer i alge cellemorfologi; bakterielle kolonidannende enhed (CFU) tæller; og flowcytometri for algernes celletal og identifikation subpopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algevækst en miniaturiseret format.
Miniaturisering af algekulturer til en 1 ml kultur volumen i en mikrotiterplade muliggør replikation i et eksperiment, der skal øges. Det er vigtigt at sikre, at algen er sundt hele et forsøg; udføre en vækstkurve (figur 2), ved hjælp af mikrotiterpladeformat at vurdere forskellige alger medier, for at sikre de ernæringsmæssige krav alge er opfyldt. Derudover kan det være vigtigt at optimere døgnets cyklus (lys og mørke perioder) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
