Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80
Summary
Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.
Abstract
As modificações pós-traducionais (PTMs), tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, e sumoilação, regular a função de muitas proteínas celulares. PTMs de proteínas cinetócoro que se associam com DNA centromeric mediar segregação cromossômica fiéis para manter a estabilidade do genoma. Abordagens bioquímicas, tais como espectrometria de massa e análise de transferência de western são mais comumente utilizado para a identificação de PTMs. Aqui, um método de purificação de proteínas está descrito que permite a detecção de ambos sumoilação e ubiquitinação das proteínas cinetocoro, Ndc10 Ndc80, e em Saccharomyces cerevisiae. Uma estirpe que expressa polihistidina-Flag-etiquetado Smt3 (HF-Smt3) e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80 foi construída e utilizada para os nossos estudos. Para a detecção de sumoylation, eu inventei um protocolo para purificar por afinidade proteínas sumoylated His-tag usando esferas de níquel e usado western blot com anti-Myc anticorpo para detectar sumoylated Ndc10 umnd Ndc80. Para a detecção de ubiquitinação, que concebido um protocolo para a imunoprecipitação das proteínas Myc-tag e utilizada a análise de Western blot com um anticorpo anti-Ub para mostrar que Ndc10 e Ndc80 são ubiquitinadas. Os nossos resultados mostram que o epitopo marcado com proteína de interesse na sua bandeira-tagged Smt3 estirpe facilita a detecção de vários PTMs. Estudos futuros deverão permitir a exploração desta técnica para identificar e caracterizar as interações proteína que são dependentes de um PTM específico.
Introduction
Ubiquitinação e sumoilação permitir a conjugação de ubiquitina e modificador pequeno Ubiquitina-like (SUMO; Smt3 em S. cerevisiae 1) para uma proteína-alvo, respectivamente. PTMs de proteínas cinetócoro afectar os níveis celulares e interacções proteína-proteína durante as diferentes fases do ciclo celular para assegurar a segregação cromossómica fiel. Por exemplo, os níveis celulares de Cse4 / CENP-A e proteína cinetócoro exterior Dsn1 são regulados através de proteólise mediada por ubiquitina para assegurar a estabilidade do genoma 2-5. A desestabilização das ligações cinetócoro-microtúbulo incorrectas requer a IPL1 / Aurora B-quinase, que fosforila e Dam1 Ndc80 complexos que interagem directamente com os microtúbulos 6-8. Apesar da identificação de mais de setenta proteínas cinetócoro, há muito poucos estudos que investigam as modificações dessas proteínas com PTMs, por exemplo, ubiquitina e SUMO. Uma limitação importante é a capacidade de preservar a PTMs durante a purificação e a escassez de anticorpos para a detecção de mercadorias, tais como PTMs sumoilação, fosforilação, metilação, e outros. Caracterização de proteínas cinetócoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizou um anticorpo costume 9. Além disso, Ndc10 tem sido implicado como um substrato para ubiquitinação 10. Hec1 Humano (Ndc80 em S. cerevisiae) é também substrato para ubiquitinação, regulamentada pelo APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Portanto, Ndc10 e Ndc80 são bons candidatos para otimização do protocolo para detectar tanto sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae.
Para facilitar a identificação de sumoilação, construiu-se as estirpes que expressam HF-Smt3 e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80. O uso de marcadores de epitopo (HF: His6-Flag) minimiza o fundo devido à reatividade cruzada que é frequentemente observada no soro policlonal criado contra uma proteína candidato. Eu inventei um protocolo de afinidadepurificar conjugados HF-Smt3 e, em seguida, utilizado anti-Flag comercial e anticorpos anti-myc para detectar a presença de sumolyated Ndc10 e Ndc80 na preparação Smt3 purificado. Para ubiquitination, eu inventei um protocolo de imunoprecipitação modificado que preserva ubiquitinação das proteínas cinetócoro Myc marcadas e realizadas análises de Western blot com o anticorpo anti-Ub comercial para detectar ubiquitination de Ndc10 e Ndc80.
Protocol
Representative Results
Discussion
Marcadores de epitopo HA, tais como, Myc, Bandeira, e GST são amplamente utilizados para análise bioquímica de proteínas. Construção de estirpes com IC-Smt3 e proteínas cinetócoro Myc-tag, como Ndc10 e Ndc80, facilita a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. HF-Smt3 puxar para baixo ensaio permite a detecção de proteínas cinetócoro sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). O protocolo de purificação por afinidade e análise Western blot utilizando anticorpo anti-Flag estabelec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
Riferimenti
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