Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Summary

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Abstract

Modificaciones post-traduccionales (PTMs), tales como fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, y sumoylation, regulan la función celular de muchas proteínas. PTM de proteínas cinetocoro que se asocian con el ADN centromérico median segregación cromosómica fieles a mantener la estabilidad del genoma. Enfoques bioquímicos como la espectrometría de masas y análisis de transferencia Western son los más utilizados para la identificación de los PTM. Aquí, un método de purificación de proteínas se describe que permite la detección de tanto sumoylation y ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en Saccharomyces cerevisiae. Una cepa que expresa etiquetados-polihistidina-Bandera Smt3 (HF-Smt3) y Myc-etiquetados Ndc10 o Ndc80 fue construido y utilizado para nuestros estudios. Para la detección de sumoylation, ideamos un protocolo para purificar por afinidad proteínas sumoylated etiquetados-Su usando perlas de níquel y utilizamos Western blot con anti-Myc anticuerpos para detectar sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Para la detección de ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación de proteínas Myc-etiquetados y utilizamos Western blot con el anticuerpo anti-Ub para demostrar que Ndc10 y Ndc80 se ubiquitinated. Nuestros resultados muestran que el epítopo de etiquetado proteína de interés en el Su-Bandera etiquetado cepa Smt3 facilita la detección de múltiples PTM. Los estudios futuros deben permitir la explotación de esta técnica para identificar y caracterizar las interacciones de proteínas que son dependientes de un PTM específico.

Introduction

La ubiquitinación y la sumoilación permiten la conjugación de la ubiquitina y el modificador Pequeño ubiquitina-like (SUMO; Smt3 en S. cerevisiae ¹⁾ a una proteína diana, respectivamente. PTMs de proteínas kinetochore afectan a sus niveles celulares y las interacciones proteína-proteína durante las diferentes fases del ciclo celular para asegurar la segregación cromosómica fiel. Por ejemplo, los niveles celulares de Cse4 / CENP-A y proteínas cinetocoro externo DSN1 están regulados por la proteólisis mediada por ubiquitina de asegurar la estabilidad del genoma ^2-5. La desestabilización de accesorios-cinetocoro microtúbulos incorrectas requiere la quinasa B Ipl1 / Aurora, que fosforila Dam1 y Ndc80 complejos que interactúan directamente con los microtúbulos ^6-8. A pesar de la identificación de más de setenta proteínas cinetocoro, hay muy pocos estudios que investiguen las modificaciones de estas proteínas con PTM, por ejemplo, ubiquitina y SUMO. Una limitación importante es la capacidad de preservar la PTMs durante la purificación y la escasez de anticuerpos personalizados para la detección de PTM tales como sumoylation, fosforilación, metilación, y otros. Caracterización de proteínas cinetocoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1 y Ndc80 utiliza un anticuerpo encargo ^9. Además, Ndc10 ha sido implicado como un sustrato para la ubiquitinación ^10. Hec1 Humano (Ndc80 en S. cerevisiae) también está sustrato para la ubiquitinación, regulado por APC / C-hCdh1 E3 ligasa ^11. Por lo tanto, Ndc10 y Ndc80 son buenos candidatos para la optimización del protocolo para detectar tanto sumoylation y ubiquitinación en S. cerevisiae.

Para facilitar la identificación de sumoylation, construimos cepas que expresan HF-Smt3 y etiquetada-Myc Ndc10 o Ndc80. El uso de etiquetas de epítopo (HF: His6-Flag) minimiza el fondo debido a la reactividad cruzada que se observa frecuentemente en el suero policlonal generado contra una proteína candidato. Hemos elaborado un protocolo de afinidadpurificar conjugados de HF-Smt3 y luego se usa anticuerpos anti-myc anti-Flag y comercial para detectar la presencia de sumolyated Ndc10 y Ndc80 en la preparación Smt3 purificado. Para ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación modificada que conserva la ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro Myc-etiquetados y realizó el análisis de Western blot con el anticuerpo anti-Ub comercial para detectar la ubiquitinación de Ndc10 y Ndc80.

Protocol

1. Crecimiento de células de levadura Inocular células de levadura en 30 ml de YPD (Tabla 1) en un matraz pequeño. Incubar a 30 ° C durante la noche con agitación. Diluir las células a una densidad óptica de 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0,2) en 50 ml de YPD y se incuba a 30 ° C con agitación. Mantener el cultivo a una densidad óptica de 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1,0). Centrifugar las células durante 5 minutos a 2.000 xg y descartar el sobr…

Representative Results

Para detectar sumoylation de proteínas cinetocoro Ndc80 y Ndc10, cepas con HF-Smt3 y proteínas cinetocoro etiquetados-Myc (Ndc80 o Ndc10) fueron construidos (Tabla 2), como se describió anteriormente 9,12. Conjugados HF-Smt3 fueron purificados por afinidad utilizando perlas de Ni-NTA. Western blot de purificado HF-Smt3 con un permitido la detección de anticuerpos anti-Bandera de formas sumoylated de sustratos SUMO que en la cepa control sin HF-Smt3 (Figura 1A y 1B…

Discussion

Etiquetas de epítopo tales como HA, Myc, Flag, GST y son ampliamente utilizados para el análisis bioquímico de las proteínas. Construcción de cepas con HF-Smt3 y kinetochore proteínas etiquetadas-Myc, tales como Ndc10 y Ndc80, facilita la detección de PTM tales como sumoylation y ubiquitinación. HF-Smt3 desplegable ensayo permite la detección de proteínas cinetocoro sumoylated, Ndc10 y Ndc80 (Figura 1). El protocolo de purificación por afinidad y análisis de transferencia Western usando anti…

Materials

Glass beads	BioSpec Products	11079105	0.5 mm dia.
Mini beadbeater	BioSpec Products	#693	8 cell disrupter
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	Primary antibody, dilution 1:1000
c-Myc antibody (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Primary antibody, dilution 1:5000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Primary antibody, dilution 1:5000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody	Covance	MMS-258R	Primary antibody, dilution 1:1000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Secondary antibody, dilution 1:5000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	Secondary antibody, dilution 1:5000
DC protein assay	Bio-Rad	500-0116
Nitrocellulose membrane	Novex	LC2001	0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Blue sensitive X-Ray film	Dbio	DBOF30003
Automatic developer	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg