البروتين تنقية تقنية تسمح الكشف عن Sumoylation وUbiquitination من الناشيء الخميرة الحيز الحركي البروتينات Ndc10 وNdc80
Summary
تصف هذه المخطوطة الكشف عن sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في مهدها خميرة الخباز.
Abstract
التعديلات بعد متعدية (PTMs)، مثل الفسفرة، مثيلة، أستلة، ubiquitination، وsumoylation، تنظيم وظيفة الخلوية من العديد من البروتينات. PTMs من البروتينات الحيز الحركي التي تربط مع DNA القسيم المركزي توسط المؤمنين العزل الصبغي للحفاظ على استقرار الجينوم. النهج البيوكيميائية مثل مطياف الكتلة وتحليل لطخة الغربي هي الأكثر شيوعا لتحديد PTMs. هنا، يتم وصف طريقة تنقية البروتين الذي يسمح للكشف عن كل من sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في خميرة الخباز. سلالة التي تعبر عن polyhistidine العلم الموسومة Smt3 (HF-Smt3) وMyc على الموسومة Ndc10 أو شيد Ndc80 وتستخدم لدراساتنا. للكشف عن sumoylation أوجدنا بروتوكول لتقارب تنقية صاحب الموسومة البروتينات sumoylated باستخدام الخرز النيكل ويستخدم تحليل لطخة الغربية مع مكافحة Myc على الأجسام المضادة للكشف عن sumoylated Ndc10 لالثاني Ndc80. للكشف عن ubiquitination، ونحن وضعت بروتوكولا للمناعي من البروتينات Myc على الموسومة ويستخدم تحليل لطخة الغربية مع مكافحة UB الأجسام المضادة لإظهار أن Ndc10 وNdc80 وubiquitinated. نتائجنا تظهر ان حاتمة الموسومة البروتين من الفائدة في صاحب العلم الموسومة سلالة Smt3 يسهل الكشف عن PTMs متعددة. ينبغي أن يسمح الدراسات المستقبلية استغلال هذه التقنية لتحديد وتوصيف التفاعلات البروتينية التي تعتمد على PTM معين.
Introduction
Ubiquitination وsumoylation السماح للتصريف بتحول والصغيرة اليوبيكويتين مثل معدل (SUMO؛ Smt3 في S. خميرة 1) إلى بروتين الهدف، على التوالي. PTMs من البروتينات الحيز الحركي تؤثر على مستويات الخلوية وتفاعلات البروتين البروتين خلال مختلف مراحل دورة الخلية لضمان المؤمنين كروموسوم العزل. على سبيل المثال، يتم تنظيم مستويات الخلايا من Cse4 / CENP-A وبروتين الحيز الحركي الخارجي Dsn1 التي كتبها بوساطة بتحول والتحلل البروتيني لضمان الاستقرار الجينوم 2-5. زعزعة استقرار إرفاق ملفات-الحيز الحركي أنيبيب غير صحيحة يتطلب B كيناز Ipl1 / أورورا، التي phosphorylates Dam1 وNdc80 المجمعات التي تتفاعل مباشرة مع ميكروتثبول 6-8. على الرغم من تحديد أكثر من سبعين البروتينات الحيز الحركي، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات إلى أن التحقيق في إدخال تعديلات على هذه البروتينات مع PTMs، على سبيل المثال، بتحول وSUMO. وجود قيود الرئيسي هو القدرة على الحفاظ على PTMالصورة خلال تنقية وندرة الأجسام المضادة مخصصة للكشف عن PTMs مثل sumoylation، الفسفرة، مثيلة، وغيرها. توصيف البروتينات الحيز الحركي sumoylated Ndc10، Cep3، تستخدم Bir1، وNdc80 الأجسام المضادة مخصصة 9. بالإضافة إلى ذلك، تم Ndc10 المتورطين باعتبارها الركيزة لubiquitination 10. Hec1 الإنسان (Ndc80 في S. الخباز) هو الركيزة أيضا لubiquitination، التي تنظمها APC / C-hCdh1 E3 يغاز 11. ولذلك، Ndc10 وNdc80 هي مرشحة جيدة لتعظيم الاستفادة من بروتوكول للكشف عن كل من sumoylation وubiquitination في S. الخباز.
لتسهيل التعرف على sumoylation، اقمنا السلالات التي تعبر عن HF-Smt3 وMyc على الموسومة Ndc10 أو Ndc80. استخدام علامات حاتمة (HF: His6 العلم) يقلل الخلفية بسبب عبر التفاعل الذي كثيرا ما لوحظ في المصل بولكلونل أثيرت ضد بروتين مرشح. نحن وضعت بروتوكولا لتقاربتنقية تقارن HF-Smt3 ثم استخدام التجاري المضادة للعلم ومعاداة Myc على الأجسام المضادة للكشف عن وجود sumolyated Ndc10 وNdc80 في إعداد Smt3 تنقيته. لubiquitination أوجدنا بروتوكول مناعي تعديل يحفظ ubiquitination من البروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة وإجراء تحليل لطخة الغربية مع التجاري مكافحة UB الأجسام المضادة للكشف عن ubiquitination من Ndc10 وNdc80.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستخدم على نطاق واسع علامات حاتمة مثل HA، Myc على، العلم، وGST لتحليل الكيمياء الحيوية للبروتينات. بناء سلالات مع HF-Smt3 والبروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة، مثل Ndc10 وNdc80، ويسهل الكشف عن PTMs مثل sumoylation وubiquitination. HF-Smt3 هدم مقايسة يسمح للكشف عن البروتينات الحيز الحركي sumoylat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
Riferimenti
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetica. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetica. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
