Sumoylation और नवोदित खमीर Kinetochore प्रोटीन Ndc10 और Ndc80 की Ubiquitination की जांच की अनुमति देता है कि प्रोटीन शोधन तकनीक
Summary
इस पांडुलिपि नवोदित खमीर में, sumoylation और kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 की ubiquitination का पता लगाने का वर्णन है।
Abstract
इस तरह के फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, एसिटिलीकरण, ubiquitination, और sumoylation के रूप में बाद translational संशोधनों (PTMs), कई प्रोटीन के सेलुलर समारोह को विनियमित। Centromeric डीएनए के साथ संबद्ध है कि kinetochore प्रोटीन की PTMs जीनोम स्थिरता बनाए रखने के लिए वफादार गुणसूत्र अलगाव मध्यस्थता। ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के रूप में जैव रासायनिक दृष्टिकोण आमतौर पर सबसे अधिक PTMs की पहचान के लिए किया जाता है। इधर, एक प्रोटीन शोधन विधि Saccharomyces cerevisiae में kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 के sumoylation और ubiquitination दोनों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि वर्णित है। Ndc10 Myc टैग या Ndc80 निर्माण किया है और हमारे अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था व्यक्त करता polyhistidine फ्लैग टैग Smt3 (HF-Smt3) और कहा कि एक तनाव। Sumoylation का पता लगाने के लिए, हम निकल मोती का उपयोग करके अपने टैग sumoylated प्रोटीन शुद्ध आत्मीयता के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और sumoylated Ndc10 एक का पता लगाने के विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इस्तेमाल कियाएन डी Ndc80। Ubiquitination का पता लगाने के लिए, हम Myc टैग प्रोटीन की immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और Ndc10 और Ndc80 ubiquitinated कर रहे हैं दिखाने के लिए कि विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इस्तेमाल किया। हमारे परिणाम उनकी फ्लैग में रुचि के मिलान में चिह्नित प्रोटीन Smt3 तनाव कई PTMs का पता लगाने की सुविधा में चिह्नित है दिखाते हैं। भविष्य के अध्ययन के लिए इस तकनीक का शोषण एक विशिष्ट PTM पर निर्भर कर रहे हैं कि प्रोटीन बातचीत की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए अनुमति चाहिए।
Introduction
क्रमश: एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए, (एस cerevisiae 1 में Smt3 सूमो) Ubiquitination और sumoylation ubiquitin और लघु Ubiquitin की तरह संशोधक का संयुग्मन अनुमति देते हैं। Kinetochore प्रोटीन की PTMs वफादार गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए अलग सेल चक्र चरणों के दौरान उनके सेलुलर स्तर और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, Cse4 / CENP-ए और बाहरी kinetochore प्रोटीन Dsn1 की सेलुलर स्तर जीनोम स्थिरता 2-5 सुनिश्चित करने के लिए ubiquitin की मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस द्वारा विनियमित रहे हैं। गलत kinetochore-सूक्ष्मनलिका अनुलग्नकों की अस्थिरता सीधे सूक्ष्मनलिकाएं 6-8 के साथ बातचीत कि Dam1 और Ndc80 परिसरों phosphorylates जो Ipl1 / अरोड़ा बी काइनेज की आवश्यकता है। सत्तर से अधिक kinetochore प्रोटीन की पहचान के बावजूद, PTMs, जैसे, Ubiquitin और सूमो के साथ इन प्रोटीनों की संशोधनों की जांच है कि बहुत कुछ अध्ययन कर रहे हैं। एक प्रमुख सीमा PTM की रक्षा करने की क्षमता हैशुद्धि और इस तरह के sumoylation, फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, और दूसरों के रूप में PTMs का पता लगाने के लिए कस्टम एंटीबॉडी की कमी के दौरान एस। Sumoylated kinetochore प्रोटीन की विशेषता Ndc10, Cep3, Bir1, और Ndc80 एक कस्टम एंटीबॉडी 9 का उपयोग किया। इसके अतिरिक्त, Ndc10 ubiquitination 10 के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में शामिल किया गया है। मानव Hec1 (एस cerevisiae में Ndc80) भी एपीसी / सी-hCdh1 E3 के ligase 11 द्वारा विनियमित, ubiquitination के लिए सब्सट्रेट है। इसलिए, Ndc10 और Ndc80 एस में sumoylation और ubiquitination दोनों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं cerevisiae।
Sumoylation की पहचान की सुविधा के लिए, हम HF-Smt3 और Myc टैग Ndc10 या Ndc80 व्यक्त कि उपभेदों का निर्माण किया। मिलान टैग (HF: His6-ध्वज) के उपयोग की वजह से अक्सर एक उम्मीदवार प्रोटीन के खिलाफ उठाया पॉलीक्लोनल सीरम में मनाया जाता है कि पार जेट के लिए पृष्ठभूमि को कम करता है। हम समानता के लिए एक प्रोटोकॉल तैयारHF-Smt3 conjugates के शुद्ध और फिर शुद्ध Smt3 तैयारी में sumolyated Ndc10 और Ndc80 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक विरोधी ध्वज और विरोधी Myc एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। Ubiquitination के लिए, हम Myc टैग kinetochore प्रोटीन की ubiquitination को बरकरार रखता है कि एक संशोधित immunoprecipitation प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और Ndc10 और Ndc80 की ubiquitination का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तरह हा, Myc, ध्वज, और जीएसटी के रूप में मिलान टैग व्यापक रूप से प्रोटीन की जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। HF-Smt3 और इस तरह के Ndc10 और Ndc80 के रूप में Myc टैग kinetochore प्रोटीन, साथ उपभेदों का निर्माण, ऐसे…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
Riferimenti
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