Protein Purification teknikk som gjør at Påvisning av Sumoylation og ubiquitinering av Spirende gjær kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80

Summary

Dette manuskriptet beskriver påvisning av sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), som fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitinering, og sumoylation, regulere den cellulære funksjonen til mange proteiner. PTMs av kinetochore proteiner som assosierer med centromeric DNA megle trofast kromosom segregering for å opprettholde genom stabilitet. Biokjemiske metoder som massespektrometri og western blot analyse er mest brukt for identifisering av PTMs. Her blir en proteinrensemetode som er beskrevet som tillater påvisning av både sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stamme som uttrykker polyhistidin-Flag-merket Smt3 (HF-Smt3) og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80 ble bygget og brukt til våre studier. For påvisning av sumoylation, utviklet vi en protokoll til affinitetskromatografi rense His-tagget sumoylated proteiner ved hjelp av nikkel perler og brukes western blot analyse med anti-Myc antistoff for å påvise sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. For påvisning av ubiquitinering, utviklet vi en protokoll for immunoprecipitation av Myc-merket proteiner og brukes western blot analyse med anti-Ub antistoff for å vise at Ndc10 og Ndc80 er ubiquitinmolekyler. Våre resultater viser at epitop tagget-protein av interesse for Hans-Flag merket Smt3 belastning letter påvisningen av flere PTMs. Fremtidige studier bør tillate utnyttelse av denne teknikken til å identifisere og karakterisere protein interaksjoner som er avhengig av en bestemt PTM.

Introduction

Ubiquitinering og sumoylation tillater konjugering av ubiquitin og små Ubiquitin lignende modifikator (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae ¹⁾ til et målprotein, respektivt. PTMs av kinetochore proteiner påvirker deres cellulære nivåer og protein-protein interaksjoner i ulike cellesyklusfaser for å sikre trofast kromosom segregering. For eksempel er cellulære nivåer av Cse4 / CENP-A og ytre kinetochore protein Dsn1 regulert av ubiquitin-formidlet proteolyse for å sikre stabilitet genom ^2-5. Destabilisering av feil kinetochore-microtubule vedlegg krever Ipl1 / Aurora B kinase som fosforylerer Dam1 og Ndc80 komplekser som direkte samhandler med mikrotubuli ^6-8. Til tross for identifisering av over sytti kinetochore proteiner, er det svært få studier som undersøker de modifikasjoner av disse proteinene med PTMs, f.eks ubiquitin og SUMO. En viktig begrensning er evnen til å bevare den PTMs under rensingen og mangelen på tilpassede antistoffer for påvisning av PTMs som sumoylation, fosforylering, metylering, og andre. Karakterisering av sumoylated kinetochore proteiner Ndc10, Cep3, Bir1, og Ndc80 benyttet en tilpasset antistoff ^9. I tillegg har Ndc10 vært innblandet som et substrat for ubiquitinering ^10. Menneskelig Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) er også substrat for ubiquitinering, regulert av APC / C-hCdh1 E3 ligase ^11. Derfor Ndc10 og Ndc80 er gode kandidater for optimalisering av protokollen for å oppdage både sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae.

For å lette identifiseringen av sumoylation, bygget vi stammer som uttrykker HF-Smt3 og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80. Bruken av epitope tags (HF: His6-Flag) minimerer bakgrunnen på grunn av kryssreaksjon som er hyppig observert i polyklonale serum reist mot en kandidat protein. Vi utviklet en protokoll for å affinitetskromatografirense HF-Smt3 konjugater og deretter brukes kommersielle anti-Flag og anti-myc antistoff for å oppdage tilstedeværelsen av sumolyated Ndc10 og Ndc80 i renset Smt3 preparatet. For ubiquitinering, utviklet vi en modifisert immunopresipitering protokoll som bevarer ubiquitinering av Myc-merkede kinetochore proteiner og utført western blot analyse med kommersiell anti-Ub antistoff for å påvise ubiquitinering av Ndc10 og Ndc80.

Protocol

1. Veksten av gjærceller Inokuler gjærceller i 30 ml YPD (tabell 1) i en liten kolbe. Inkuber ved 30 ° C over natten med risting. Fortynn cellene til en optisk tetthet på 0,2 ved 600 nm (OD 600 = 0,2) i 50 ml YPD og inkuber ved 30 ° C med risting. Dyrk kulturen til en optisk tetthet på 1,0 ved 600 nm (OD 600 = 1,0). Sentrifuger cellene i 5 min ved 2000 xg og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 40 ml sterilt vann o…

Representative Results

For å oppdage sumoylation av kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10, stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner (Ndc80 eller Ndc10) ble konstruert (tabell 2), som tidligere beskrevet 9,12. HF-Smt3 konjugater ble affinitetsrenset bruker Ni-NTA perler. Western blot-analyse av renset HF-Smt3 med et anti-Flag-antistoff tillot påvisning av sumoylated former SUMO substrater som var fraværende i kontrollstammen uten HF-Smt3 (figur 1A og 1B, venstre pan…

Discussion

EPITOP koder som HA, Myc, flagg, og GST er mye brukt til biokjemisk analyse av proteiner. Bygging av stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner, slik som Ndc10 og Ndc80, letter påvisningen av PTMs som sumoylation og ubiquitinering. HF-Smt3 trekke ned analysen tillater påvisning av sumoylated kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80 (figur 1). Den affinitetsrensing protokollen og western blot analyse ved hjelp av anti-Flag antistoff etablere spesifisitet av samspillet mellom HF-Smt3 og målpr…

Materials

Glass beads	BioSpec Products	11079105	0.5 mm dia.
Mini beadbeater	BioSpec Products	#693	8 cell disrupter
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	Primary antibody, dilution 1:1000
c-Myc antibody (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Primary antibody, dilution 1:5000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Primary antibody, dilution 1:5000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody	Covance	MMS-258R	Primary antibody, dilution 1:1000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Secondary antibody, dilution 1:5000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	Secondary antibody, dilution 1:5000
DC protein assay	Bio-Rad	500-0116
Nitrocellulose membrane	Novex	LC2001	0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Blue sensitive X-Ray film	Dbio	DBOF30003
Automatic developer	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg