Protein reningsteknik som möjliggör detektion av Sumoylation och ubikvitinering av knoppande jäst kinetochore Proteiner Ndc10 och Ndc80
Summary
Detta manuskript beskriver upptäckten av sumoylation och ubikvitinering av kinetokoren proteiner, Ndc10 och Ndc80, i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Posttranslationella modifikationer (PTMs), såsom fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitinering, och sumoylation, reglera den cellulära funktionen av många proteiner. PTMs av kinetokoren proteiner som associerar med centromerisk DNA förmedla trogen kromosomsegregation att upprätthålla genomet stabilitet. Biokemiska metoder såsom masspektrometri och Western blot-analys används oftast för identifiering av PTMs. Här, är en proteinreningsmetod som beskrivits som möjliggör detektering av både sumoylation och ubikvitinering av kinetochor proteiner, Ndc10 och Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stam som uttrycker polyhistidin-Flag-märkt Smt3 (HF-Smt3) och Myc-märkta Ndc10 eller Ndc80 konstruerades och användes för våra studier. För detektion av sumoylation, utarbetade vi ett protokoll för att affinitetsrena His-taggade sumoylated proteiner genom att använda nickel pärlor och används western blot-analys med anti-Myc antikropp för att detektera sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. För detektion av ubikvitinering, utarbetade vi ett protokoll för immunfällning av Myc-märkta proteiner och används western blot-analys med anti-Ub-antikropp för att visa att Ndc10 och Ndc80 är ubiquitineras. Våra resultat visar att epitopmärkt-protein av intresse i His-flaggan märkt Smt3 stam underlättar detektionen av multipla PTMs. Framtida studier bör tillåta utnyttjande av denna teknik för att identifiera och karakterisera proteininteraktioner som är beroende av en specifik PTM.
Introduction
Ubiquitinering och sumoylation tillåta konjugering av ubikitin och små Ubiquitin-liknande modifierare (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae 1) till ett målprotein, respektive. PTMs av kinetokoren proteiner påverkar deras cellulära nivåer och protein-proteininteraktioner under olika cellcykelfaser för att säkerställa trogen kromosomsegregation. Till exempel är cellulära nivåerna av Cse4 / CENP-A och yttre kinetochor protein Dsn1 regleras av ubikitin-förmedlad proteolys för att säkerställa genomet stabilitet 2-5. Destabilisering av felaktiga kinetokoren-mikrotubuli bilagor kräver Ipl1 / Aurora B-kinas, som fosforylerar Dam1 och Ndc80 komplex som direkt interagerar med mikrotubuli 6-8. Trots att identifiera över sjuttio kinetokoren proteiner, finns det mycket få studier som undersöker de modifikationer av dessa proteiner med PTMs, t.ex., ubikvitin och SUMO. En viktig begränsning är möjligheten att bevara PTMs under rening och bristen på anpassade antikroppar för detektion av PTMs såsom sumoylation, fosforylering, metylering, och andra. Karakterisering av sumoylated kinetokoren proteiner Ndc10, Cep3, Bir1 och Ndc80 utnyttjade en anpassad antikropp 9. Dessutom har Ndc10 implicerats som ett substrat för ubikitinering 10. Human Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) är också substrat för ubikitinering, regleras av APC / C-hCdh1 E3 ligas 11. Därför Ndc10 och Ndc80 är goda kandidater för optimering av protokoll för att upptäcka både sumoylation och ubikvitinering i S. cerevisiae.
För att underlätta identifieringen av sumoylation, konstruerade vi stammar som uttrycker HF-Smt3 och Myc-märkta Ndc10 eller Ndc80. Användningen av epitopmärkningar (HF: His6-Flag) minimerar bakgrunden på grund av korsreaktivitet som ofta observeras i polyklonalt serum som tagits fram mot en kandidatprotein. Vi utarbetat ett protokoll för att affinitetsrena HF-Smt3 konjugat och användes sedan i handeln förekommande anti-Flag och anti-Myc-antikroppar för att detektera närvaron av sumolyated Ndc10 och Ndc80 i den renade Smt3 preparatet. För ubiquitinering, utarbetade vi en modifierad immunoprecipitation protokoll som bevarar ubikitinering av Myc-taggade kinetokoren proteiner och utförde western blot-analys med kommersiellt anti-Ub antikropp för att detektera ubikitinering av Ndc10 och Ndc80.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitopmärkningar såsom HA, Myc, sjunker, och GST används allmänt för biokemisk analys av proteiner. Konstruktion av stammar med HF-Smt3 och Myc-märkta kinetokoren proteiner, såsom Ndc10 och Ndc80 underlättar detekteringen av PTMs såsom sumoylation och ubikvitinering. HF-Smt3 dra ner analysen möjliggör detekteringen av sumoylated kinetokoren proteiner, Ndc10 och Ndc80 (figur 1). Den affinitetsreningsprotokoll och western blot-analys med användning av anti-Flag antikropp fastställa specificit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
Riferimenti
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetica. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetica. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
