フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術
Summary
多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。
Abstract
細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。
Introduction
細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。
また、微粒子としても知られている電気自動車は、細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセス1の多様な調節を助けている体液中に見出される小さな膜由来の小胞である。 4 –様々な表面マーカーおよび/ または生物学的物質の直接転写の発現を介して、電気自動車は、細胞間コミュニケーションに2を活性化または抑制の役割のいずれかを再生するためにレシピエント細胞の機能を変化させることができる。他の腫瘍metastaを促進するから、広範な条件に寄与することが示されているが、臨床的に、血小板由来電気自動車は、強力な抗凝固活性5を有することが知られている病気7からの保護にSIS 6。電気自動車は、発電8のサイズやメカニズムに応じて、そのようなエキソソームと微小胞（MVの）などの細胞由来の小胞の小さいカテゴリーに分類することができる。細胞由来の小胞の集団の命名法は、MVSは1,000百大きいながらしかし、エキソソームは、一般的に、形質膜とエンドソームの融合に由来し、小さな、40から100ナノメートルの粒子として記載されている、現在進行中の議論8,9の話題であり続け原形質膜10の脱落によって形成さ以下の粒子。ここで、一般的な用語「電気自動車」とは、細胞によって放出される細胞外の生物小胞の全てのタイプを指すために使用される。
全血からのEVの単離は、多段階の手順であり、多くの異なる処理変数は、保存温度および期間11,12を含む、EVの内容に影響することが示されている、抗凝固剤/防腐剤13を使用し遠心法14を用いた。これらの変数の標準化の必要性は、適切な血液処理とEV分離手順のための血栓止血科学と標準化委員会（ISTH SSC）に関する国際学会勧告15,16につながっている、まだ、最適なプロトコル上の研究者の間でコンセンサスは存在しない12を使用する。最も厳密に制御前分析変数は、正確で再現性のあるデータのために重要であることが同意する。
電気自動車を分析するために、研究者らは、透過型電子顕微鏡17、走査型電子顕微鏡18,19、原子間力顕微鏡、20,21およびウェスタンブロッティング22,23を動的光散乱を含む様々な方法を利用している。 FCMは、多くの研究9,24のための選択の方法であるが–高いスループット能力に起因26、FCMを用いた電気自動車の分析がされている32 –そのサイズと離散正の集団27の欠如に難しいことで知ら。細胞の分析に比べて、必要となる粒子当たりの抗原の少ない数に起因して放出された1）以下蛍光電気自動車結果のサイズが小さく、後染色洗浄2）限られた可能性は、バックグラウンド蛍光を減少させる。研究者の間で共通の課題は、免疫グロブリン凝集体27,28および抗体29の自己凝集から生じる信号を含む。さらに、長い処理時間と現在のプロトコル33,34の多くで使用される長い洗濯/単離方法は、高スループットのアプリケーションに理想的で、それらが少なくなって、少数のサンプルを分析するために、マルチ日の時間のコミットメントを必要とする。一部の研究者は、正確にBACを評価するため、蛍光マイナス1（FMO）と抗体アイソタイプ役に立たないとして伝統的に使用されるFCMネガティブコントロールのレンダリング、完全に洗浄ステップを見送るkground蛍光30。
抗体凝集体および他の非小胞、非結合抗体を除去するのに難しさ、および識別可能な正の集団の不足から生じる信号：我々のプロトコルは、EVの適切なFCM分析を妨げることができる3つの一般的な問題に対処する。ここで説明される技術は、一般に市販の調製物に見られる抗体凝集体を排除する信号対雑音比を増加させると、バックグラウンド蛍光の検出を最小限にする合理的な方法でゲートを設定することで支援する。二つの異なる検出方法がここに提示されている：第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。
Protocol
Representative Results
Discussion
EVの単離、処置および分析のための2つの異なるプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示された。使用する最も適切な方法を選択することは必ずしも容易ではなく、興味のある個々の亜集団と同様にテストされているサンプルを理解する必要があります。最も適切な方法を選択する際にさらに、取得のために使用されるサイトメーターの感度を…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、機器の設定、フローサイトメーターとの彼の助けのための血液システム開発センターからデイルHirschkornに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金HL095470とU01 HL072268と国防総省の契約W81XWH-10-1-0023とW81XWH-2から0028によってサポートされていました。
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
Riferimenti
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