유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술
Summary
많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.
Abstract
세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 – 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.
Introduction
세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 – 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.
또한 미세 입자로 알려진 전기 자동차는 세포 – 세포 통신에 관여 생물학적 과정 (1)의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이되는 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 4 – 다양 표면 마커 및 / 또는 생물학적 물질의 직접 전사 식을 통해, 전기차가 활성화 또는 세포 간 통신 (2)에서의 역할을 억제하거나 재생받는 세포의 기능을 변경할 수있다. 다른 종양 촉진 metasta에서, 광범위한 조건에 기여하는 것으로 도시되었지만 임상 혈소판 유래 전기차는 강력한 항 응고 활성을 5 것으로 알려진질병 (7)에 대한 보호에 동생 (6). 전기차는 크기와 (8)의 생성 메커니즘에 따라 엑소 좀과 같은 마이크로 소포 (조작량) 등을 세포 유래 소포 작은 범주로 분류 될 수있다. MVS가 100~1000를 클수록 동안 세포 유래 소포 개체군의 명칭이 지속적인 논쟁 -8,9- 화제가되고 있지만, 엑소 좀은 일반적으로 소형으로 세포막과 엔도 좀의 융합으로부터 유도 40~100 nm의 입자를 설명한다 나노 입자들은 세포막의 열 발산에 의해 형성되어있다. 여기서, 일반적인 용어 "전기 자동차"는 세포에 의해 세포 외 방출 생물학적 소체의 모든 유형을 참조하는 데 사용된다.
전혈에서 전기차의 분리 다단계 절차 및 다양한 처리 변수는 보관 온도와 기간 (11, 12), 항응고제 / 방부제를 사용하고 (13)를 포함하여 EV 콘텐츠에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다원심 분리 방법 (14)을 사용했다. 이러한 변수의 표준화에 대한 요구가 혈전증 및 지혈 과학 적절한에 대한 표준화위원회 (ISTH SSC) 혈액 처리 및 EV 격리 절차 15, 16에 대한 국제 사회에 의해 추천되었다, 아직 최적의 프로토콜에 연구자간에 합의가 존재하지 않았다 (12)를 사용합니다. 대부분 미리 엄격하게 제어 변수 분석이 정확하고 재현성에 매우 중요한 데이터 있다는 것이 동의.
전기차를 분석하기 위하여, 연구자들은 22, 23, 20, 21 및 웨스턴 블롯 산란 투과 전자 현미경 (17), 주사 전자 현미경 (18,19), 원자력 현미경, 동적 광을 포함한, 다양한 방법을 이용했다. FCM은 많은 연구자 9,24에 대한 선택의 방법이지만 – 인해 높은 처리 능력을 26, FCM을 사용하여 전기 자동차의 분석은있다32 – 그들의 크기와 이산 긍정적 인 인구 27의 부족으로 어렵기로 악명이 높다. 세포의 분석에 비해 필요가 입자 당 항원의 적은 수로 인해 방출 1) 적은 형광의 전기 자동차 결과의 작은 크기와 후 얼룩 세척 2) 제한된 타당성, 배경 형광을 줄일 수 있습니다. 연구자들 사이 일반적인 문제는 면역 글로불린 집계 (27, 28) 및 항체 (29)의 자체 집계에서 발생하는 신호를 포함한다. 또한, 긴 처리 시간 및 현재 프로토콜 33,34 많은 의해 사용 긴 세척 / 분리 절차는 그들에게 높은 처리량 애플리케이션에 이상적 미만을, 적은 수의 샘플을 분석하기 위해 여러 날 동안의 투입을 요구한다. 일부 연구자들은 정확하게 혈중 알코올 농도를 평가하기위한 형광 물질 하나를 뺀 (FMO)과 항체 이소 타입 쓸모으로 전통적으로 사용 FCM 음성 대조군 렌더링, 모두 세척 단계를 지내다kground 형광 (30).
항체 집계 및 기타 비 소포, 언 바운드 항체를 제거하는 어려움과 식별 할 수있는 긍정적 인 인구의 부족에서 발생하는 신호 : 우리의 프로토콜은 전기 자동차의 적절한 FCM 분석을 방해 할 수있는 세 가지 일반적인 문제를 해결합니다. 여기에 기재된 기술은, 일반적으로 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거하는 신호 대 잡음비를 증가시키고 배경 형광의 검출을 최소화 합리적인 방식으로 게이트를 설정을 지원한다. 두 개의 서로 다른 검출 방법들이 여기에 제시된다 : 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은, 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
격리, 치료 및 전기 자동차의 분석을위한 두 개의 서로 다른 프로토콜이 각각 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여, 발표되었다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 선택하는 것은 간단하지 않다 항상 관심 개별 소집단뿐만 아니라 테스트되는 샘플의 이해를 요구한다. 가장 적절한 방법을 선택할 때 또한, 취득 사용 계측기의 감도가 고려되어야한다. 때때로 아니라, 방법의 조합은 혼자 어느…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 장비 설정 사이토 흐름에 그의 도움을 혈액 시스템 연구소에서 데일 Hirschkorn에게 감사의 말씀을 전합니다. NIH에 의해 지원되었다이 작품은 HL095470 및 U01의 HL072268과 국방부 계약 W81XWH-10-1-0023 및 W81XWH-2-0028을 부여합니다.
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
Riferimenti
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