Techniques pour l'analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux
Summary
De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l'aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.
Abstract
Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.
Introduction
Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.
VE, aussi connu comme microparticules, sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques 1. À travers l'expression de différents marqueurs de surface et / ou le transfert direct de matériel biologique, les véhicules électriques sont en mesure de modifier la fonction des cellules réceptrices de jouer soit l'activation ou la suppression de rôles dans la communication intercellulaire 2-4. VE, dérivées des plaquettes cliniquement sont connus pour avoir une forte activité anticoagulante 5, tandis que d'autres ont été montrés pour contribuer à une large gamme de conditions, de la promotion tumorale metasta6 sis à protéger contre la maladie 7. VE peuvent être classés en catégories plus petites vésicules de dérivés de cellules tels que les exosomes et microvésicules (MV), en fonction de leur taille et le mécanisme de génération 8. La nomenclature des sous-populations de vésicules dérivées de cellules continue d'être un sujet de débat en cours 8,9, cependant, les exosomes sont généralement décrits comme petite, de 40 à 100 nm particules provenant de la fusion des endosomes avec la membrane plasmique, tandis que MV sont plus de 100 à 1000 des particules nm formés par l'excrétion de la membrane plasmique 10. Ici, le terme général "VE" sera utilisé pour désigner tous les types de vésicules biologiques extracellulaires libérés par les cellules.
Isolement des véhicules électriques à partir de sang entier est une procédure en plusieurs étapes et de nombreuses variables différentes de traitement se sont révélés affecter le contenu EV, y compris la température et la durée de stockage 11,12, anticoagulant / conservateur utilisé 13 etméthode de centrifugation utilisée 14. Un besoin de standardisation de ces variables a abouti à des recommandations de la Société internationale de thrombose et de traitement du sang et d'isolement EV procédures du Comité de normalisation (ISTH SSC) pour le bon Hémostase scientifiques et 15,16, mais il ne existe aucun consensus parmi les chercheurs sur le protocole optimal à utiliser 12. La plupart conviennent, cependant, que les variables pré-analytiques étroitement contrôlées sont cruciales pour les données précises et reproductibles.
Afin d'analyser les véhicules électriques, les chercheurs ont utilisé diverses méthodes, y compris la microscopie électronique à transmission 17, la microscopie électronique à balayage 18,19, microscopie à force atomique, la lumière diffusion dynamique de 20,21 et 22,23 western blot. Alors que la FCM est la méthode de choix pour de nombreux chercheurs 9,24 – 26 en raison de ses capacités à haut débit, analyse des véhicules électriques en utilisant la FCM a éténotoirement difficile en raison de leur taille et le manque de populations positifs discrets 27-32. Par rapport à l'analyse des cellules, la petite taille des résultats de SVE en 1) moins de fluorescence émise en raison du nombre inférieur d'antigènes par particule et 2) la faisabilité limitée de post-tache lavage, ce qui est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond. Défis communs entre les chercheurs comprennent signaux issus agrégats d'immunoglobulines 27,28 et auto-agrégation des anticorps 29. En outre, les longs délais de traitement et procédures de lavage / d'isolement de longs utilisés par un grand nombre de protocoles actuels 33,34 nécessitent des engagements de temps de plusieurs jours pour analyser un petit nombre d'échantillons, ce qui les rend moins idéal pour les applications à haut débit. Certains chercheurs renoncent à une étape de lavage tout à fait, rendant traditionnellement utilisés contrôles négatifs FCM telles que la fluorescence moins un (FMO) et isotypes d'anticorps inutile pour évaluer précisément bacfluorescence kground 30.
Nos protocoles portent sur trois problèmes communs qui peuvent entraver l'analyse de la FCM correcte des véhicules électriques: signaux issus des agrégats d'anticorps et d'autres non-vésicules, de la difficulté à éliminer l'anticorps non lié, et le manque de populations positifs perceptibles. Les techniques décrites ici seront utiles pour éliminer les agrégats d'anticorps on trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-sur-bruit, et la mise en portes de façon rationnelle qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Deux méthodes de détection différentes sont présentés ici: le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur des perles-de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deux protocoles différents pour l'isolement, le traitement et l'analyse des véhicules électriques ont été présentés, soit en utilisant une détection individuelle ou une approche à base de billes. Sélection de la méthode la plus appropriée à utiliser ne est pas toujours simple et nécessite une compréhension de l'échantillon testé ainsi que les sous-populations individuelles d'intérêt. En outre, la sensibilité du cytomètre utilisée pour l'acquisition doit être considéré au mome…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Dale Hirschkorn de Blood Systems Research Institute pour son aide avec cytomètre de flux réglages de l'appareil. Ce travail a été soutenu par le NIH et accorde HL095470 U01 HL072268 et contrats DoD W81XWH-10-1-0023 et W81XWH-2-0028.
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
Riferimenti
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