Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Summary

Många olika metoder finns för mätning av extracellulära vesiklar (EVT) med användning av flödescytometri (FCM). Flera aspekter bör beaktas vid fastställandet av den lämpligaste metoden att använda. Två protokoll för mätning elbilar presenteras, antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt.

Abstract

Extracellulär Blåsor (EVS) är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är mycket engagerade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer. Analys av elbilar använder flödescytometri (FCM) har varit notoriskt svårt på grund av sin ringa storlek och brist på diskreta populationer positiva för markörer av intresse. Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Tyvärr, det finns ingen one-size-fits-all protokoll, och flera aspekter måste beaktas vid bestämning av lämpligaste metoden att använda. Presenteras här finns flera olika tekniker för bearbetning elbilar och två protokoll för att analysera elbilar använder antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanliga i kommersiella beredningar, ökar signal-brusförhållande, och inställningsgrindar i en rationell fashion som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder en pärla baserad metod för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.

Introduction

Extracellulär Blåsor (EVS) är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är mycket engagerade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer. Analys av elbilar använder flödescytometri (FCM) har varit notoriskt svårt på grund av sin ringa storlek och brist på diskreta populationer positiva för markörer av intresse. Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Tyvärr, det finns ingen one-size-fits-all protokoll, och flera aspekter måste beaktas vid bestämning av lämpligaste metoden att använda. Presenteras här finns flera olika tekniker för bearbetning elbilar och två protokoll för att analysera elbilar använder antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanliga i kommersiella beredningar, ökar signal-brusförhållande, och inställningsgrindar i en rationell fashion som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder en pärla baserad metod för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.

Elbilar, även känd som mikropartiklar, är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är involverade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer ^1. Genom uttryck av olika ytmarkörer och / eller direkt överföring av biologiskt material, elbilar kan ändra funktionen hos mottagarceller för att spela antingen aktivera eller undertrycka roller i kommunikationen mellan ^2-4. Kliniskt, elbilar trombocytrelaterade är kända för att ha en stark antikoagulerande aktivitet ^5, medan andra har visat sig bidra till ett brett spektrum av förhållanden, från att främja tumör metastasis ⁶ att skydda mot sjukdomar ^7. Elbilar kan delas in i mindre grupper av celler erhållna vesiklar såsom exosomes och mikrovesiklar (MV), beroende på deras storlek och mekanismen för generering ^8. Nomenklaturen för-cellerna vesikler subpopulationer fortsätter att vara ett ämne för pågående debatten ^8,9 dock exosomes generellt beskrivs som små, 40 till 100 nm partiklar härrörande från endosomal fusion med plasmamembranet, medan MV är större 100 till 1.000 nm partiklar som bildas genom att kasta av plasmamembranet ^10. Här kommer den allmänna termen "elbilar" användas för att hänvisa till alla typer av extracellulära biologiska vesiklar släpptes av celler.

Isolering av elbilar från helblod är ett förfarande i flera steg och många olika behandlingsvariabler har visats påverka EV innehåll, inklusive lagringstemperatur och varaktighet ^11,12, antikoagulantia / konserveringsmedel som används ¹³ ochcentrifuge metod som används ^14. Ett behov av standardisering av dessa variabler har lett till rekommendationer från International Society om Thrombosis and Haemostasis Vetenskapliga och standardiseringskommitté (ISTH SSC) för korrekt bearbetning blod och EV isoleringsförfaranden ^15,16, men det finns ingen enighet bland forskare om den optimala protokollet att använda ^12. De flesta är dock överens om att hårt kontrollerade pre-analytiska variabler är avgörande för exakta och reproducerbara data.

För att analysera elbilar, har forskarna utnyttjat olika metoder, inklusive transmissionselektronmikroskopi ^17, svepelektronmikroskopi ^18,19, atomkraftsmikroskopi, dynamisk ljusspridning ^20,21 och western blotting ^22,23. Medan FCM är metoden för många forskare ^{9,24 – 26} på grund av dess höga genomströmning kapacitet, har analyser av elbilar använder FCM varitnotoriskt svårt på grund av sin storlek och brist på diskreta positiva befolknings ^27-32. Jämfört med analys av celler, till den lilla storleken hos EVS resulterar i en) mindre fluorescens som emitteras på grund av det färre antal antigen per partikel och 2) begränsad genomförbarhet av post-fläck tvättning, vilket är nödvändigt minska bakgrundsfluorescens. Gemensamma utmaningar bland forskare inkluderar signaler som härrör från immunglobulinaggregat ^27,28 och själv aggregering av antikroppar ^29. Dessutom de långa handläggningstider och långa tvätt / isoleringsförfaranden som används av många av de nuvarande protokollen ^33,34 kräver flerdagars tid åtaganden för att analysera ett litet antal prover, vilket gör dem mindre än idealisk för hög genomströmning applikationer. Vissa forskare avstå ett tvättsteg helt och hållet, vilket gör traditionellt används FCM negativa kontroller såsom fluorescens minus ett (FMO) och antikroppsisotyper värdelös för exakt bedöma background fluorescens ^30.

Våra protokoll upp tre vanliga problem som kan hindra ett korrekt FCM analys av elbilar: signaler som härrör från aggregat antikropps och andra icke-vesikler, svårt att ta bort obunden antikropp, och brist på både positiva befolkningar. De tekniker som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanligen återfinns i kommersiella preparat, ökar signal-till-brusförhållande, och att sätta grindar på ett rationellt sätt som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Två olika detektionsmetoder presenteras här: den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder ett pärlor baserad strategi för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.

Protocol

OBS: Följande protokoll har utförts i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. Alla humana ämnesprover testades under en institutionell översyn ombord (IRB) -godkänd protokoll och med informerat samtycke av försökspersonerna. 1. METOD A: Individuell Detection Method 1.1) Behandling av blodprov / Isolering av elbilar Dra blod från donator / patienten i två 10 ml glasrör innehållande 1…

Representative Results

Figur 1 visar det övergripande systemet för isolering och detektion av elbilar med antingen pärlan baserad metod eller enskilda detektionsmetod bearbetning. Individuell upptäckt av elbilar använder FCM fungerar bra för att analysera stora elbilar men de flesta cytometrar inte kan individuellt detektera partiklar så små som exosomes. En pärla baserat tillvägagångssätt gör små elbilar som ska upptäckas, men det finns nackdelar med att använda denna metod, som beskrivs i tabel…

Discussion

Två olika protokoll för isolering, behandling och analys av elbilar presenterades, med antingen en individuell detektering eller pärla baserat synsätt. Välja den lämpligaste metoden att använda är inte alltid enkelt och kräver en förståelse av provet som testas samt individuella subpopulationer av intresse. Dessutom måste känslighet cytometern används för förvärv beaktas när man väljer den lämpligaste metoden. Ofta finns det inget enskilt bästa protokoll som ska användas, snarare en kombination av …

Materials

LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12×75 polystrene	BD Biosciences	352058
50mL Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips – 10µL	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200µL	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips – 1000µL	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230