Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido
Summary
A continuación, presentamos un protocolo para inyectar medios de contraste de microburbujas de ultrasonidos en la vida, aislados finales de la gestación de embriones murinos etapa. Este método permite el estudio de los parámetros de perfusión y de marcadores moleculares vasculares dentro del embrión utilizando imágenes de ultrasonido de alta frecuencia con contraste.
Abstract
Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.
Introduction
La ecografía con contraste hace uso de agentes de contraste de microburbujas de visualizar y caracterizar el ambiente vascular. Estos agentes permiten la evaluación no invasiva de la microcirculación, la vascularización y la función cardiovascular. Además, la modificación de la superficie de la burbuja puede resultar en microburbujas específica de unión a los biomarcadores endoteliales, como se ha demostrado en aplicaciones preclínicos de la angiogénesis, la aterosclerosis y la inflamación 1,2 toma de imágenes por ultrasonido molecular de eventos vasculares posibles. Por lo tanto, un mayor contraste de ultrasonido puede ser usado para identificar los entornos complejos y diversos que influyen en los estados vasculares sanas y enfermas 3-5.
En el último número de años, el interés en la utilidad de las imágenes de microburbujas se ha extendido al modelo de embrión de ratón versátil. Como modelo de desarrollo de los mamíferos, la introducción de microburbujas en la vasculatura embrionaria mejora fisiológicaestudio del desarrollo del sistema circulatorio (por ejemplo, el flujo sanguíneo, el gasto cardíaco) y en casos de transgénicos y dirigidos modelos de ratones mutantes de la enfermedad cardíaca 6,7, puede ayudar a comprender cómo los factores genéticos alterar la función cardiovascular. De hecho, los análisis 2D cuantitativa y cualitativa de la vasculatura del cerebro embrionario ya se han logrado 8. Además, el embrión de ratón se presenta como un modelo excelente para examinar la unión de microburbujas dirigidas a los marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. 9, por ejemplo, han introducido microburbujas avidina en embrión ventrículos cardíaco para evaluar dirigido específicamente vinculante en Biotag-Bira embriones transgénicos y examinar la anatomía vascular. La generación de modelos heterocigotos y homocigotos ratón también puede ser utilizado como un sustituto de los estudios de modelos tumorales con el objetivo de definir la naturaleza cuantitativa de ultrasonido molecular – un punto de referencia importante en la traducción de esta técnica a la clínica.
<p clculo = "jove_content"> microburbujas se presentó con mayor frecuencia a la circulación embrionaria a través de inyecciones intra-cardiaca en embriones únicos expuestos a través de una laparotomía 8-10. En inyecciones útero, sin embargo, se enfrentan a una serie de desafíos. Estos incluyen la orientación de la inyección, la necesidad de contrarrestar el movimiento en la madre y el embrión exteriorizada, el mantenimiento de la viabilidad de hemodinámica en la madre y embriones exteriorizados, abordando los efectos a largo plazo de la anestesia y las complicaciones por sangrado 11. Por lo tanto, el objetivo de la investigación fue desarrollar una técnica para la inyección de microburbujas en aislados de vida embriones en etapa tardía 12. Esta opción ofrece más libertad en términos de control de la inyección y el posicionamiento, la reproducibilidad del plano de formación de imágenes sin obstrucción, y análisis de imagen simplificada y cuantificación.En el presente estudio, se describe un nuevo procedimiento para la inyección de microburbujas en que viven los embriones murinos FOr los efectos de estudiar el comportamiento cinético de microburbujas y de estudiar la unión a marcadores de superficie endoteliales endógenos de microburbujas dirigidas. Ecografía específica contraste no lineal se utiliza para medir una serie de parámetros de perfusión básicos, incluyendo la mejora de pico (PE), lavandería en la tasa y el tiempo hasta el pico (TTP) en aislados embriones E17.5. También demuestran la validez del modelo de embrión para evaluar la naturaleza cuantitativa de la ecografía molecular en una pérdida de la endoglina embrionario de modelo de ratón transgénico función, donde la endoglina es una diana clínicamente relevante debido a su alta expresión en las células endoteliales vasculares en los sitios de angiogénesis activa 13 . La adhesión de isotipo IgG de rata de control de la endoglina 2-dirigida (MB E), (MB C) y (U) MB microburbujas no focalizados se evalúa en la endoglina heterocigotos (Esp +/-) y homocigotos endoglina (Eng + / +) que expresan embriones. Análisis del bindi apuntadong revela que el ultrasonido molecular es capaz de diferenciar entre los genotipos endoglina y relacionando densidad de los receptores a los niveles cuantificables de ultrasonido moleculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los agentes de contraste de ultrasonido fueron inyectadas en la última etapa de la gestación de embriones de ratón y las imágenes de contraste no lineales fueron adquiridos para medir parámetros de perfusión y microburbujas dirigidos vinculante. El éxito de formación de imágenes de microburbujas dentro de la vasculatura embrionaria era dependiente de una serie de factores, siendo el primero la viabilidad del embrión. Todo el equipo y el aparato se prepararon de antemano con el fin de minimizar el tiempo requer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.
Materials
| Reagents | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Antibodies (biotinylated, eBioscience) | Antibody choice depends on the experiment | ||
| rat isotype IgG2 control | eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
| biotin anti-mouse CD309 | eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
| Distilled water | |||
| Embryo media | |||
| 500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose | Sigma | D5796 | |
| 50 mL Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
| Hepes | Gibco | 15630 | 5mL, 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep |
| Ethanol, 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
| Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
| Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Cell culture plates (4) : 100×20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Cell culture plates (12) : 60×15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
| Conical tubes, 50 mL BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
| Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
| Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
| Gloves | Ansell | 4002 | |
| Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hot plate | VWR | 89090-994 | |
| Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
| Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
| Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
| Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
| Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| Scissors | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” | VWR | 63010-007 | |
| Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
| Surgical microscope 5-8x magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Syringes, 1 mL Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Syringes (10), 30 mL | VWR | CA64000-041 | |
| Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110oC | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 |
Riferimenti
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