Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all'interno dell'embrione con mdc alta frequenza ecografica.
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Articolo metodologico
Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging con mezzo di contrasto a ultrasuoni può trasmettere informazioni quantitative essenziali riguardanti la vascolarizzazione e la perfusione dei tessuti e, in applicazioni mirate, facilitare il rilevamento e la misurazione dei biomarcatori vascolari a livello molecolare. All'interno dell'embrione di topo, questa tecnica non invasiva può essere utilizzata per scoprire i meccanismi di base alla base dello sviluppo vascolare nel sistema circolatorio precoce del topo e nei modelli genetici delle malattie cardiovascolari. L'embrione di topo si presenta anche come un eccellente modello per studiare l'adesione di microbolle a bersagli angiogenici (incluso il recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare 2 (VEGFR2) o αv β3) e per valutare la natura quantitativa dell'ecografia molecolare. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per introdurre agenti di contrasto a ultrasuoni nel sistema vascolare di embrioni vivi e isolati. Ciò consente libertà in termini di controllo e posizionamento dell'iniezione, riproducibilità del piano di imaging senza ostruzioni e movimenti e analisi e quantificazione semplificate delle immagini. Gli embrioni murini in fase gestazionale avanzata (giorno embrionale (E)16.6 e E17.5) sono stati isolati dall'utero, delicatamente esteriorizzati dal sacco vitellino e sono stati iniettati agenti di contrasto a microbolle nelle vene accessibili sulla superficie corionica del disco placentare. L'ecografia con contrasto non lineare è stata quindi impiegata per raccogliere una serie di parametri di perfusione di base (aumento del picco, tasso di wash-in e tempo per il picco) e quantificare il legame mirato delle microbolle in un modello murino di endoglina. Mostriamo il successo della circolazione delle microbolle all'interno degli embrioni viventi e l'utilità di questo approccio nella caratterizzazione della vascolarizzazione embrionale e del comportamento delle microbolle.
Introduzione
Mdc ecografia fa uso di mezzi di contrasto microbolle di visualizzare e caratterizzare l'ambiente vascolare. Questi agenti consentono la valutazione non invasiva del microcircolo, vascolarizzazione e la funzione cardiovascolare. Inoltre, la modifica della superficie bolla può provocare microbolle mirate legame biomarker endoteliali, come dimostrato in applicazioni preclinici di angiogenesi, aterosclerosi e infiammazione 1,2 rendendo molecolare ecografico di eventi vascolari possibili. Ultrasuoni può quindi essere utilizzato per identificare gli ambienti complessi e diversi che influenzano gli stati vascolari sani e malati 3-5.
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Protocollo
NOTA: Le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono stati approvati dal Comitato per animali al Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procedure per il trattamento umano degli animali devono essere rispettate in ogni momento. Si presume che il ricercatore è addestrato nel funzionamento di base di un sistema di imaging ad ultrasuoni. Questo protocollo funziona meglio con due persone.
1. Modelli animali
- Mate CD-1 maschile e femminile Mus musculus di ottenere embrioni wild type per gli studi di perfusione.
- Per gli studi di imaging molecolare, generare Eng +/- topi per ricombinazione....
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Risultati
L'iniezione di mezzi di contrasto ad ultrasuoni nella ex utero embrioni di topo dipende l'isolamento successo viventi, embrioni fase tardiva gestazionale dall'utero e manutenzione della redditività nel corso dell'iniezione e relativo ecografica. Una volta che l'embrione è stato esteriorizzato e posizionato, come mostrato in Figura 1, è possibile accurata iniezione di mezzo di contrasto nel sistema vascolare embrionale. Una immagine ecografica B-mode tipiche di un embrione di.......
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Discussione
Mezzi di contrasto ecografici sono state iniettate in fase tardo-embrioni di topo di gestazione e le immagini di contrasto non lineari sono stati acquisiti per misurare parametri di perfusione e mirato microbolle vincolanti. Immagini di successo di microbolle all'interno di vasi embrionali era dipendente da una serie di fattori, il primo embrione di essere redditività. Tutte le attrezzature ed apparecchi sono stati preparati in anticipo in modo da minimizzare il tempo necessario per l'isolamento di embrioni dall.......
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Dichiarazioni
F.S. Foster riconosce il suo ruolo di consulente per VisualSonics Inc.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Terry Fox Program del National Cancer Institute of Canada.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Anticorpi (biotinilato, eBioscience) — La scelta dell'anticorpo dipende dall'esperimento | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | Questa combinazione anticorpo/microbolla è spesso richiesta come controllo sperimentale |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| Anticorpo MJ 7/18 di ratto biotinilato contro l'endoglin di topo | Ibridoma | Gli anticorpi esterni possono anche essere appropriati: abbiamo utilizzato eBioscience (13-1051-85) in passato | |
| Acqua | |||
| Embryo media | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | lotto # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 ml, 1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 ml, 10.000 unità Pen., 10.000 μ g Etanolo da streptococco |
| , 70% | |||
| di ghiaccio | |||
| Paraformaldeide | Sigma | 76240 | 4% |
| soluzione salina tamponata con fosfato [1x] | Sigma | D8537 | 1x, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio |
| Topo incinta, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| Cloruro di sodio (soluzione fisiologica) allo 0,9% | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Mezzo di contrasto ad ultrasuoni, MicroMarker pronto per il bersaglio e non mirato | ; VisualSonics Inc. | ||
| Gel per ultrasuoni (Aquasonic 100, incolore) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Piastre per colture cellulari (4) : 100 x 20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Piastre per colture cellulari (12) : 60 x 15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuga | Sorvall Legend RT centrifuga | ||
| Provette coniche, 50 ml BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluente | Beckman Coulter | Isoton II Diluente, 8448011 | |
| Forbici da dissezione (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Pinze (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinze, scheggia | VWR | 25601-134 | |
| Bicchiere in vetro, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Capillari in vetro, 1 x 90 mm GD-1 con filamento | Narishige | GD-1 | |
| Estrattore per aghi in vetro | Narishige | PN-30 | |
| Guanti | Ansell | 4002 | |
| Sonda anatomica lorda | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Piastra riscaldante | VWR | 89090-994 | |
| Secchiello per il ghiaccio | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Piattaforma | VisualSonics Inc. | di binari integrato | |
| Sorgente luminosa, fibra ottica | Fisher Scientific | 12-562-36 | Idealmente ha bracci regolabili |
| Luers (12), femmina spinata in polipropilene ¼-28 Filettatura UNF | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Sistema micro-ultrasuoni, ad alta frequenza | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Aghi, calibro 21 (1") | VWR | 305165 | |
| Analizzatore granulometrico | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Cucchiaio perforato (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Perni (6), nero anodizzato minuzia 0,15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettatori [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1.000 μ l] | Eppendorf | Research Plus 3120000038 regolabile; 3120000054; | |
| Punte per pipettatore [2-200 μ l, 50-1.000 μ l] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; | |
| Kit elastomero | |||
| VWR | 63010-007 | ||
| Stick applicatore in legno (tampone, testina di cotone) | VWR | CA89031-270 | |
| Microscopio operatorio Ingrandimento 5-8X | Fisher Scientific | Steromaster | |
| , 1 ml Siringhe Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| (10), 30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| Pompa per infusione siringa | Bio-lince | Termometro NE-1000 | |
| , -20-110 ° C | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Valvole, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Rack per provette (3) | VWR | 82024-462 | |
| Trasduttore a ultrasuoni, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angolato verso l'alto | Fine Science Tools | 15005-08 | |
Riferimenti
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
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Ristampe e permessi
