Die Biokonjugation und Radiosynthese⁸⁹ Zr-DFO-markiertem Antikörper

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

Die außergewöhnliche Affinität, Spezifität und Selektivität der Antikörper machen sie außergewöhnlich attraktive Vektoren für den Tumor gerichtet PET-Radiopharmaka. Aufgrund ihrer mehrtägigen biologische Halbwertszeit muss Antikörper mit Positronen emittierende Radionuklide mit relativ langen physischen Verfall Halbwertszeiten zu kennzeichnen. Traditionell sind die Positronen emittierende Isotope ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 h) und ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 h) wurden verwendet, um Antikörper zu beschriften PET-Bildgebung. In jüngerer Zeit jedoch hat das Feld eine dramatische Zunahme in der Verwendung der Positronen emittierende Radiometall ⁸⁹ Zr in Antikörper-basierten PET-Bildgebungsmittel beobachtet. ⁸⁹ Zr ist ein nahezu ideales Radioisotop für die PET-Bildgebung mit Immunkonjugaten, da sie eine physikalische Halb besitzt -Leben (t _1/2 = 78,4 Stunden), die mit den in-vivo-Pharmakokinetik von Antikörpern kompatibel ist und gibt eine relativ niedrige energy Positronen, die Bilder mit hoher Auflösung produziert. Außerdem Antikörper können unkompliziert mit ⁸⁹ Zr mit dem Siderophor abgeleitete Chelator Desferrioxamin (DFO) gekennzeichnet werden. Bei diesem Protokoll wird die Prostata-spezifische Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung eines ⁸⁹ Zr- DFO-mAb Radioimmunkonjugat, und (3) in-vivo-PET mit einem ⁸⁹ Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs.

Introduction

Aufgrund ihrer bemerkenswerten Empfindlichkeit, Affinität und Selektivität wurden Antikörper langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen. Jedoch wurde ihre Anwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) durch das Fehlen eines geeigneten Positronen emittierende Radioisotope für die Etikettierung behindert. ^1-3 Einer der kritischsten Aspekte bei der Konzeption der Radioimmunkonjugate wird passend zum physikalischen Zerfall Halb Zeit des Radioisotops für die in vivo Pharmakokinetik des Antikörpers. Genauer gesagt wurden Antikörper oft relativ lang, mehrtägigen biologischen Halbwertszeit und müssen daher mit Radioisotopen mit vergleichbaren physikalischen Halbwertszeit gekennzeichnet sein. Für PET-Imaging-Anwendungen, haben Antikörper traditionell mit radioaktiv markiertem ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 h), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 Stunden) oder ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d). ^{4, 5} jedoch jedediese Radioisotope besitzt erhebliche Einschränkungen, die ihre Eignung für die klinische Bildgebung behindern. Während Radioimmunkonjugate mit ⁸⁶ Y und ⁶⁴ Cu beschriftet sind vielversprechend in präklinischen Untersuchungen nachgewiesen, beide Isotope besitzen physikalische Halbwertszeiten, die zu kurz, um effektiv für die Bildgebung beim Menschen sind. ¹²⁴ I hingegen hat eine nahezu ideale physikalische Halbwertszeit für Bildgebung mit Antikörpern, aber es ist teuer und hat suboptimal Abklingeigenschaften, die relativ geringe Auflösung klinischen Bildern führen. Ferner können ¹²⁴ I-markiertem Radioimmunkonjugaten Subjekt in vivo Dehalogenierung, ein Verfahren, das Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse senken kann. ^6,7

Der Antrieb, ein Positronen emittierende Radioisotop zu ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y ersetzen zu finden, und ¹²⁴ I in Radioimmunkonjugate hat den jüngsten Anstieg der Forschung über ⁸⁹ Zr-markierten Antikörpern angeheizt. ^8-12 Ter Grund für die Einführung der ⁸⁹ Zr ist einfach: das Radiometall besitzt nahezu idealen chemischen und physikalischen Eigenschaften für den Einsatz in diagnostischen PET Radioimmunkonjugate ^{13 89} Zr wird über die ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ Zr Reaktion auf ein Zyklotron mit einer produziert. im Handel erhältlich und 100% natürlich reichlich ⁸⁹ Y Ziel. ^14,15 Die Radiometall hat eine Positronen-Ausbeute von 23%, zerfällt mit einer Halbwertszeit von 78,4 Stunden und Positronen emittiert mit der relativ geringen Energie von 395,5 keV (Abbildung 1). ^13,16,17 Es ist wichtig zu beachten, dass ⁸⁹ Zr emittiert ebenfalls eine hohe Energie 909 keV γ-Strahl mit 99% Effizienz. Während dieser Emission nicht energetisch nicht mit den emittierten 511 keV Photonen, erfordert es zusätzliche Überlegung im Hinblick auf Transport, Handling und Dosimetrie. Trotz dieser Einschränkung, diese Zerfallseigenschaften letztlich bedeuten, dass ⁸⁹ Zr hat nicht nur eine günstigere hAlf-Lebensdauer für die Bildgebung mit Antikörpern als ⁸⁶ Y und ⁶⁴ Cu kann aber auch erzeugen Bilder mit höherer Auflösung als ¹²⁴ I, welche mit Positronen höheren Energien von 687 bis 975 keV und einer Anzahl von Photonen mit Energien innerhalb 100-150 keV emittiert die 511 keV Positronen erzeugt Photonen. ^13. Darüber hinaus ist ⁸⁹ Zr auch sicherer in der Handhabung und weniger teuer herzustellen und residualizes in Tumoren wirksamer als sein Gegenstück Radiojod. ^18,19 Eine mögliche Einschränkung von ⁸⁹ Zr ist, dass es keinen ein therapeutisches Isotopolog zB ⁸⁶ Y (PET) vs. ⁹⁰ Y (Therapie). Dies schließt die Konstruktion von chemisch identischen, Surrogat-Bildgebungsmittel, die als dosimetrische scouts für ihre therapeutischen Gegen eingesetzt werden können. Das heißt, Untersuchungen legen nahe, dass ⁸⁹ Zr-markierten Antikörpern zu tun haben Potenzial als Bild Surrogate für ⁹⁰ Y und ¹⁷⁷ Lu-markierten Immunkonjugate.^20,21

Vom chemischen Standpunkt aus als ein Metall der Gruppe IV, besteht ⁸⁹ Zr als vier Kationen in wässriger Lösung. Die Zr ⁴⁺ Ion hoch geladenen, relativ groß (effektive Ionenradius = 0,84 Å), und kann als eine "harte" Kation klassifiziert werden. Als solches weist es eine Präferenz für die Liganden mit bis zu acht Fest anionische Sauerstoffdonatoren. Einfach die häufigste Chelator in ⁸⁹ Zr-markierten Radioimmunkonjugate verwendete Desferrioxamin (DFO), ein Siderophor-abgeleitete, azyklische Chelator, die drei Hydroxamatgruppen. Der Ligand stabil koordiniert den Zr ⁴⁺ Kationen schnell und sauber bei RT bei biologisch relevanten pH-Werten, und das erhaltene Zr-DFO-Komplex bleibt stabil im Laufe mehrerer Tage in Kochsalzlösung, Blutserum und Vollblut. ²² Computational Studien stark darauf hin, dass DFO bildet einen sechsfach koordinierten Komplex mit Zr ⁴⁺ in dem das Metallzentrum an die Drei Neut koordiniertral und drei anionische Sauerstoffdonoren des Liganden sowie zwei exogene Wasserliganden (Abbildung 2). ^23,24 Die in vivo Verhalten Radioimmunkonjugate Einsatz der ⁸⁹ Zr-DFO Konjugation Gerüst war im Allgemeinen sehr gut. Jedoch in einigen Fällen, Bildgebung und Biodistribution akuten Studien erhöhten Aktivität in den Knochen von Mäusen mit ⁸⁹ Zr-markierte Antikörper injiziert wird, Daten, die zeigt, dass die osteophiles ⁸⁹ Zr ⁴⁺ Kation aus der Chelator in vivo freigesetzt und anschließend mineralisiert ergab in den Knochen. ²⁵ Kürzlich, insbesondere Liganden eine Reihe von Untersuchungen über die Entwicklung von neuartigen ⁸⁹ Zr ⁴⁺ Chelatoren mit acht Sauerstoffspender sind in der Literatur erschienen. ^24,26,27 Dennoch derzeit DFO ist die am weitesten verbreiteten Chelator mit großem Abstand in ⁸⁹ Zr-markierten Radioimmunkonjugate. Eine Vielzahl von unterschiedlichenBiokonjugation Strategien wurden angewendet, um den DFO Antikörper binden, einschließlich bioorthogonalen Click-Chemie, die Reaktion von thiolreaktiven DFO Konstrukte mit Cysteine ​​im Antikörper, und die Reaktion des aktivierten Esters tragenden DFO Konstrukte mit Lysinen in den Antikörper. ^{4,28- 30} leicht die häufigste Strategie jedoch ist die Verwendung von einem Isothiocyanat tragende Derivat von DFO, DFO-NCS (Abbildung 2). ²² Diese kommerziell verfügbaren bifunktionellen Chelator robust und zuverlässig stabile, kovalente Bindungen mit Thioharnstoff Lysine der Formen Antikörper (Abbildung 3).

In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von ⁸⁹ Zr-DFO-markierten Radioimmunkonjugaten in der Literatur berichtet worden. Präklinische Untersuchungen haben besonders reichlich gewesen, mit Antikörpern, die von der bekannteren Cetuximab, Bevacizumab und Trastuzumab mehr esoterischen Antikörper wie die CD105-Targeting-TRC105 und fPSA-Targeting 5A10. ^30-36 In jüngerer Zeit sind eine geringe Anzahl von frühen Phase der klinischen Studien mit ⁸⁹ Zr-DFO-markierte Antikörper in der Literatur aufgetaucht. Insbesondere Gruppen in den Niederlanden veröffentlichten Studien beschäftigt ⁸⁹ Zr-DFO-CMAB U36, ⁸⁹ Zr-DFO-Ibritumomab-Tiuxetan, und ⁸⁹ Zr-DFO-Trastuzumab. ^21,32,37 Darüber hinaus eine Reihe von weiteren klinischen Studien mit ⁸⁹ Zr-markierten Radioimmunkonjugate sind derzeit im Gange, einschließlich Untersuchungen hier am Memorial Sloan Kettering Cancer Center mit dem PSMA-Targeting ⁸⁹ Zr-DFO-J591 für Prostata-Krebs-Bildgebung und die HER2-Targeting ⁸⁹ Zr-DFO-Trastuzumab bei Brustkrebs Bildgebung. ^{23, 30} Darüber hinaus, während radiomarkierten Antikörpern bleiben die häufigsten ⁸⁹ Zr-markierte Radiopharmaka, die Radio auch zunehmend mit anderen Vektoren, einschließlich Peptide, Proteine ​​und Nanomaterialien eingesetzt. ^38-43 </sup>

Die Modularität dieser ⁸⁹ Zr-DFO Kennzeichnungsmethode ist eine enorme Bereicherung. Das Repertoire der Biomarker-Targeting-Antikörper ist immer größer, und das Interesse an der Durchführung in vivo PET-Bildgebung mit diesen Konstrukten legt kräftig zu. Als Ergebnis, glauben wir, dass die Entwicklung standardisierter Verfahren und Protokolle können Sie das Feld profitieren. Eine ausgezeichnete schriftliche Versuchsprotokoll für DFO-NCS Konjugation und ⁸⁹ Zr Radiomarkierung wurde bereits von Vosjan veröffentlicht, et al. ²² Wir sind der Meinung, dass die visuelle Demonstration von dieser Arbeit bereitgestellt könnte weiter helfen Ermittler neue zu diesen Techniken. In dem Protokoll bei Seits wird die Prostata-spezifischen Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung des ⁸⁹ Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugats,und (3) in vivo PET mit ⁸⁹ Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs. ^23,44,45

Protocol

Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Konjugation von DFO-NCS bis J591 In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2-5 mg / ml-Lösung von J591 in 1 ml von entweder 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) oder 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4). Löse DF…

Representative Results

Der erste Schritt bei diesem Protokoll die Konjugation DFO-NCS an den Antikörper ist typischerweise ziemlich robust und zuverlässig. Im Allgemeinen kann die gereinigte Chelator modifizierten Immunkonjugat in> 90% Ausbeute erhalten werden, und unter Verwendung von 3 Moläquivalenten DFO-NCS in der Anfangs Konjugationsreaktion wird eine Anpassungsgrad-Markierung der Chelatbildner von etwa 1,0-1,5 DFO zu erhalten / mAb. Die 89 Zr radioaktiven Markierung und Reinigungsschritte des Verfahrens sind ebenfalls e…

Discussion

Während die Konstruktion, radioaktive Markierung, und Abbildung ⁸⁹ Zr-DFO-beschriftet Radioimmunkonjugate ist in der Regel ein ziemlich einfaches Verfahren, ist es wichtig, ein paar wichtige Überlegungen bei jedem Schritt des Prozesses zu halten. Beispielsweise, wenn die wahrscheinlichste Ursache für Bedenken während der Konjugation Schritt der Prozedur ist die Aggregation des Antikörpers während der Konjugationsreaktion. Dieses Problem ist häufig ein Produkt von schlechter Vermischung der Konjugations…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide