バイオコンジュゲーションとのアルタン⁸⁹のZr-DFO標識抗体

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

例外的な親和性、特異性、および抗体の選択性は、それらの腫瘍標的PET放射性医薬品のための非常に魅力的なベクトルを作る。それらの複数日生物学的半減期に、抗体は、比較的長い物理的な崩壊の半減期を持つ陽電子放出放射性核種で標識されなければならない。伝統的に、陽電子放出同位体¹²⁴ I（T _1/2 = 4.18 ^D）、86 Y（T _1/2 = 14.7時間）、および⁶⁴のCu（T _1/2 = 12.7時間）がための抗体を標識するために使用されてきたPETイメージング。しかし、最近では、フィールドは、抗体ベースのPETイメージング剤における陽電子放出放射性金属⁸⁹ Zrの使用の劇的な増加を目撃した。それは物理的な半分を所有として⁸⁹ Zrは、免疫複合体のPETイメージングのためのほぼ理想的な放射性同位体である抗体のインビボ薬物動態と互換性があり、比較的低いエンを発する-Life（T _1/2 = 78.4時間）高解像度の画像を生成するRGY陽電子。さらに、抗体は、直接にシデロフォア由来のキレート剤デスフェリオキサミン（DFO）を使用して^、89 Zrを用いて標識することができる。このプロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）抗体、（2）放射性合成および⁸⁹ Zr-の精製-イソチオシアネートDFO二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーションDFO-mAbでの放射性免疫複合体、および癌のマウスモデルにおける⁸⁹のZr-DFO-mAbでの放射性免疫複合体（3） のインビボ PETイメージング。

Introduction

それらの著しい感度、親和性、及び選択性は、抗体は、長い癌細胞への放射性同位体を送達するためのベクターとして有望と考えられてきた。しかしながら、陽電子放出断層撮影（PET）イメージングへの応用は、それらの標識に適した陽電子放出放射性同位体の欠如によって妨げられてきた。放射性免疫複合体の設計において最も重要な考慮事項^1-3 One物理減衰に一致さ半二重抗体のin vivoでの薬物動態への放射性同位元素の生活。より具体的には、抗体は、しばしば、比較的長い、複数日の生物学的半減期を有し、従って、同等の物理的半減期を有する放射性同位体で標識されなければならない。 PETイメージング用途のために、抗体は、伝統的に⁶⁴のCu（トン_1/2 = 12.7時間^）、86 Y（tの_1/2 = 14.7時間）、または¹²⁴ I（t _1/2は= 4.18 d）の放射性標識されている^{。4、 5}しかし、それぞれのこれらの放射性同位元素は、臨床イメージングのための適性を妨げる重大な限界を有している。 ⁸⁶ Y及び⁶⁴ Cuで標識された放射性免疫複合体は、前臨床研究において有望であることが証明されているが、両方の同位体は、ヒトでのイメージングのために有効であるには余りにも短い物理的半減期を有する^。124 I、対照的に、のためのほぼ理想的な物理的半減期を有する抗体を用いたイメージングが、それは高価であり、比較的低解像度の臨床画像につながる次善の減衰特性を有している。さらに^、124 I-標識放射性免疫複合体は、 インビボでの腫瘍対バックグラウンド活性比を低下させることができるプロセスを脱ハロゲン化の対象となることができる^。6,7

⁶⁴のCuに取って代わる陽電子放出放射性同位元素^、86 Yを見つけるために、ドライブ、および放射性免疫複合体中の¹²⁴ Iは⁸⁹ Zrの標識抗体の研究の最近の急増に燃料を供給しています^。8-12 T⁸⁹ Zrの出現のために彼の理由は簡単である：放射性診断のPET放射性免疫複合体において使用するためのほぼ理想的な化学的および物理的特性を有している^{13 89} Zrは⁸⁹ Y た（p、n）を用いてサイクロトロンでの⁸⁹ Zrの反応を介して生成される。市販の100％天然に豊富な⁸⁹ Yターゲット^。14,15放射性金属は、23％の陽電子収率が78.4時間の半減期で崩壊し、395.5 keVの（ 図1）の比較的低いエネルギーで陽電子を放出する。 ^13,16,17これは^、89 Zrは、高エネルギーを放出することに留意することが重要で、909 keVのγ線99％の効率を有する。この発光は放出される511keVの光子を精力的に干渉しないが、それは、輸送、取り扱い、および線量測定に関して余分な配慮を必要としません。この警告にもかかわらず、これらの減衰特性は、最終的に⁸⁹ Zrをより良好な時間を持っていないだけであることを意味Cuの⁸⁶ Yおよび⁶⁴より抗体によるイメージングのためのアルフ寿命もより高い687と975 keVのエネルギーの同様の100-150 keVの内のエネルギーを有する光子の数と陽電子を放出する^、124 Iよりも高い解像度の画像を生成することができる511keVの陽電子が作成した光子は^。13また^、89 Zrがまた製造するのに安価で、取扱いが安全で、より効果的に放射性ヨウ素の対応物よりも腫瘍において^{residualizes。89} Zrの^18,19つの潜在的な制限は、それが持っていないということです治療アイソトポマー、 例えば ^、86 Y（PET）対⁹⁰ Y（療法）。これは、それらの治療の対応のための線量測定スカウトとして用いることができる化学的に同一の、サロゲート造影剤の構築を妨げる。とはいえ、調査は⁸⁹ Zrの標識抗体が⁹⁰ Y軸^、177呂標識免疫複合体のためのイメージング·サロゲートとしての可能性を持っていることを示唆している。^20,21

化学的な観点からは、第IV族金属として^、89 Zrが水溶液中で4カチオンとして存在する。のZr ⁴⁺イオンが高度に、比較的大きな（有効イオン半径= 0.84オングストローム）で充電され、「ハード」カチオンとして分類することができる。このように、ハードディスク8、アニオン性酸素ドナーまで軸受リガンドに対する選好を示す。簡単に⁸⁹ Zrの標識放射性免疫複合体で使用される最も一般的なキレート剤は、デスフェリオキサミン（DFO）、3ヒドロキ基を有するシデロフォア由来の、非環式キレート剤である。リガンドは、安定的に生物学的に関連するpHレベルでRTで迅速かつクリーンジルコニウム^{4+カチオン}を調整し、得られたジルコニウム-DFO複合体は、生理食塩水、血清、全血における複数日にわたって安定なままである²²計算の研究が強く示唆DFOは、金属中心三NEUTに配位しているのZr ⁴⁺を有する配位錯体を形成すること然とリガンドの三アニオン性酸素ドナーならびに2つの外因性の水のリガンド （ 図^{2）。23,24 89}のZr-DFO抱合足場を採用した放射性免疫複合体のin vivoでの挙動は、一般的に優れたています。しかし、いくつかのケースでは、イメージングおよび急性生体内分布の研究は⁸⁹ Zrの標識抗体を注射したマウスの骨において高活性レベルを明らかにし、データosteophilic ⁸⁹のZr ⁴⁺イオンがインビボでキレート剤から放出され、その後、無機化されていることを示唆している骨に。8酸素ドナーが文献に登場していると^25は最近、小説⁸⁹のZr ⁴⁺キレート剤の開発の調査の数は特に、現在では、それにもかかわらず^{、24,26,27。}リガンドDFOは、最も広く採用さキレート剤である大差で⁸⁹ Zrの標識放射性免疫複合体で。異なるさまざまな生物結合戦略は、チオール反応性DFOの反応は抗体中のシステインを構築し、活性化エステル有利子DFOの反応は、抗体中のリジンを構築し、バイオ直交クリックケミストリーを含む、抗体にDFOを取り付けるために使用されてきた^{。4,28- 30は}簡単に、最も一般的な戦略、しかし、DFO、DFO-NCS（ 図2）のイソチオシアネート-ベアリング誘導体の使用であった^。22この市販の二官能性キレート剤は、堅牢かつ確実のリジンとの安定した、共有結合チオ尿素結合を形成し、抗体（ 図3）。

過去数年にわたり^、89のZr-DFO標識放射性免疫複合体の多種多様な文献に報告されている。前臨床研究は、そのようなCD105を標的とするTとセツキシマブ、ベバシズマブ、およびトラスツズマブより難解な抗体に、よりよく知られているに至るまで抗体をフィーチャーし、特に豊富だったRC105とfPSAのターゲティング5A10は^30-36より最近では^、89のZr-DFO標識抗体を使用して初期段階の臨床試験の少数が文献に登場した。具体的には、オランダのグループは^、89のZr-DFO-cmAb ^U36、89のZr-DFO-イブリツモマブチウキセタン、及び⁸⁹のZr-DFO-トラスツズマブを用いた試験を公開している。加えて^{、21,32,37、89}と他の臨床試験の範囲Zrの標識放射性免疫複合体は、前立腺癌のイメージングおよび乳癌イメージングのためのHER2を標的とする⁸⁹のZr-DFO-トラスツズマブPSMAを標的と⁸⁹のZr-DFO-J591を使用して、ここでメモリアルスローンケタリングがんセンターの調査を含め、現在進行中である^。23、放射性標識された抗体は、最も一般的な⁸⁹のZrで標識した放射性医薬品のままさらに^30、放射性もますますペプチド、タンパク質、ナノ材料を含む他のベクターに用いられてきた^。38-43 </sup>

この⁸⁹のZr-DFOラベリング方法論のモジュール性は途方もない資産である。バイオマーカーを標的とする抗体のレパートリーは、拡大を続けるであり、これらの構築物を用いて、生体 PETイメージングで行う際の関心はたちまち成長しています。その結果、我々はより標準化された実践とプロトコルの開発は、フィールドを利益を得ることができると信じています。 DFO-NCSの共役と⁸⁹のZr放射性標識のための優れた書かれた実験プロトコルは、すでにら Vosjan、によって出版されました^。22私たちは、この仕事が提供する視覚的なデモはさらにこれらの技術に新しい研究者を助けることができると感じています。手元プロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）は、抗体へのDFO -イソチオシアネート、二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーション^、89（2）放射合成及び精製ZR-DFO-のmAb放射性免疫複合体、（3）癌のマウスモデルにおける⁸⁹のZr-DFO-のmAb放射性免疫複合体によるインビボ PETイメージング^。23,44,45

Protocol

記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理指針の下で実施した。 DFO-NCSの1抱合J591へ 1.7ミリリットルのマイクロ遠心管中で、1×リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）中、0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）のいずれか1ml中J591 2-5 mg / mlの溶液を調製する。 5-10ミリ（3.8か?…

Representative Results

抗体にこのプロトコルの最初のステップDFO-NCSの結合は、一般的に非常に堅牢で信頼性の高いです。一般的に、精製され、キレート剤で修飾された免疫複合体は、> 90％の収率で得ることができ、初期結合反応にDFO-NCSの3モル当量を使用する度標識約1.0~1.5 DFOのキレート剤が得られる/モノクローナル抗体。手順の89 Zrの放射性標識および精製工程も同様に簡単です。上記のプロトコル?…

Discussion

⁸⁹のZr-DFO-表示のある放射性免疫複合体の建設、放射性標識、およびイメージングは、一般的に、むしろ簡単な手順ですが、それはプロセスの各ステップの間に念頭に置いて、いくつかの重要な考慮事項を維持することが重要である。例えば、おそらく手続きの共役工程中の懸念の原因として最も可能性が高い結合反応中の抗体の集合体である。この問題は、ほとんどの場合、DFO-NCSス…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide