Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Neurogenese ist ein stark reguliert, mehrstufiges Verfahren, bei dem neue Neuronen aus einer aktivierten neuronalen Stammzelle über setzen verstärkt Zwischenvorläufertypen erzeugt. Jede dieser Subtypen exprimiert ein Satz spezifischer molekularer Marker, der zusammen mit spezifischen morphologischen Kriterien können für die Identifikation verwendet werden. Typischerweise werden Immuntechniken aufgebracht mit Subtyp-spezifische Antikörper in Kombination mit exo- oder endogenen Proliferationsmarker. Wir beschreiben hier Immunmarkierung Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von allen Stadien der Erwachsenen Neurogenese. Diese umfassen die Anwendung der Thymidinanaloga, transkardialer Blutung, Gewebeverarbeitung, hitzeinduzierter Epitopdemaskierung, ABC Immunhistochemie, mehrere indirekte Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Zell Quantifizierung. Außerdem eine sequentielle Mehrfachimmunfluoreszenz-Protokoll, das Probleme u umgeht präsentieren wirsually sich aus der Notwendigkeit der Verwendung von primären Antikörpern in den gleichen Wirtsspezies erhöht. Es ermöglicht eine genaue Identifizierung aller Hippocampus-Vorläuferuntertypen zusammen mit einem Proliferationsmarker in einem einzigen Abschnitt. Diese Techniken sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung der unterschiedlichen Vorläufertypen parallel, ihre Beteiligung an der Hirnerkrankungen und deren Rolle in spezifischen Gehirnfunktionen zu untersuchen.
Introduction
Zwei Hirnregionen konstitutiv erzeugen neue Nervenzellen während des gesamten Lebens, das Subventrikularzone der Seitenventrikel und der Subgranularzone (SGZ) des Gyrus dentatus des Hippocampus (DG). Die neugeborenen Neuronen stammen aus neuralen Vorläuferzellen und durchlaufen verschiedene Stadien der morphologischen und physiologischen Entwicklung vor Erreichen der Geschlechtsreife 1,2. Aus einem sich langsam teil radialen Gliazellen artigen Stammzellen (Typ 1) aufeinanderfolgenden Stufen der transit amplifying Zwischenvorläuferzellen entstehen. Je mehr undifferenzierte Untertypen (Typ 2a und Typ 2b) eine unregelmäßige Form mit kurzen, tangentialen Prozesse. Sie erzeugen Neuroblasten (Typ 3), die nach und nach in den Zellzyklus verlassen, um unreife Neuronen werden (mit Dendriten erweitert in Richtung der molekularen Schicht) und schließlich in den Hippocampus-Netzwerk als reife Körnerzellen zu integrieren. Aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften diese Zellen stellen die Schaltung mit verbesserter Plastizität 3 suggesting eine einzigartige Rolle bei der Funktion des Hippocampus. Eigentlich Studien der letzten zehn Jahre generiert erhebliche Beweise dafür, dass die adulte Neurogenese trägt zur räumlichen Gedächtnisses, Muster Trennung und emotionales Verhalten 4,5.
Adulte Neurogenese kann durch verschiedene Ansätze untersucht werden. Thymidinanaloga integrieren in die DNA während der S-Phase des Zellzyklus und ermöglichen Geburt aus, Quantifizierung und Schicksal Analyse der neugeborenen Zellen 6-8. Sequentielle Anwendung unterschiedlicher Thymidin-Analoga (zB CldU, EdU oder IdU) kann zur Zellerneuerung oder Zellpopulationen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs des Experiments 9 geboren untersuchen. Eine Alternative, endogenen Marker für Zellproliferation Ki67. Es ist in sich teilenden Zellen in allen Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M), mit Ausnahme der Ruhephase (G0) und dem Beginn des G1 10,11 ausgedrückt. Um den Phänotyp Neugeborenen Zellpopulationen in der Erwachsenen dentat analysierene Gyrus mehrere stufenspezifische molekulare Marker wie GFAP, Nestin, DCX und NeuN 1,6 verwendet werden. GFAP ist ein Marker für reife Astrozyten wird aber auch in radialer Gliazellen-ähnlichen Zellen in der adulten Vorderhirn exprimiert. Nestin ist ein Zwischenfaden spezifisch für radiale Glia-ähnlichen Zellen und frühen Zwischen Progenitorzellen. DCX ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein in Zwischenvorläuferzellen, Neuroblasten und unreife Neuronen exprimiert. Auf der Grundlage der (Mit-) Expression dieser drei Marker und die morphologischen Merkmale der markierten Zellen vier verschiedene Vorläuferzelltypen zu unterscheiden: Typ 1 (GFAP +, Nestin +, DCX -), Typ 2a (GFAP – Nestin + , DCX -) Typ 2b (GFAP – Nestin +, DCX +) und Typ 3 (GFAP – Nestin -, DCX +) ein. Co-Kennzeichnung von DCX mit NeuN, die in postmitotischen Neuronen exprimiert wird, ermöglicht die Differenzierung von immature (DCX +, NeuN +) und reifen (DCX -, NeuN +) Körnerzellen.
Die oben genannten Markierungen werden häufig für Immunofluoreszenz co-Kennzeichnung und anschließende konfokale Mikroskopie verwendet, um die Anzahl und die Identität von neugeborenem Zellen zu analysieren. Dies erfordert typischerweise Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies zu unerwünschten Antikörper Kreuzreaktivität verhindern. Allerdings ist die Mehrzahl der primären Antikörper für die Neurogenese Forschung angehoben entweder in Kaninchen oder Mäusen (zB Maus-α-BrdU, Maus α-NeuN, Kaninchen α-Ki67, Kaninchen α-GFAP). Dies führt zu starken Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl und Kombination von Antigenen, die in einer einzigen Scheibe ausgewertet werden konnte. Dies wiederum nicht steigt nur der Färbung Aufwand, da mehrere Färbungen müssen durchgeführt werden, sondern könnte auch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Darüber hinaus sind einige Antigene anfällig für Formalinfixierung induzierte Epitop Maskierung (zB Ki67Nestin). Wir beschreiben hier Änderungen von den klassischen Ein- und Mehr Immunomarkierung Protokolle (zB Epitopdemaskierung, mehrere aufeinander folgende Immunfärbung, die Verwendung von Nestin-GFP transgenen Mäusen, 12), die viele dieser Probleme zu überwinden. Insbesondere erlaubt die sequenzielle Mehrfachimmunfärbungsprotokolls gegen bis zu vier unterschiedlichen Antigene auch wenn ein Teil der Antikörper wird aus dem gleichen Wirt stammen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Typ 1, Typ 2a, 2b Typ und Typ 3-Vorläuferzellen, sowie ihre proliferative Aktivität innerhalb einer einzelnen Seite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantifizierung und Identifizierung von Subpopulationen von neugeborenen Zellen ist ein zentrales Thema in der adulten Neurogenese Forschung. Die Kombination von Proliferationsmarker und Antikörper gegen Proteine in bestimmten Phasen der adulten Neurogenese ausgedrückt ermöglicht immunhistochemischen Nachweis dieser Subpopulationen. Einige der Antikörper oder Antikörperkombinationen erfordern spezifische Färbung Bedingungen.
Kennzeichnung von sich teilenden Zellen mit synthetisch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Riferimenti
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