A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Neurogênese adulta é altamente regulado, processo multi-estágio em que novos neurônios são gerados a partir de uma célula-tronco neurais ativadas via cada vez mais comprometidos subtipos progenitoras intermediários. Cada um destes subtipos expressa um conjunto de marcadores moleculares específicos que, em conjunto com os critérios morfológicos específicos, podem ser usadas para a sua identificação. Tipicamente, técnicas de imunofluorescência, são aplicadas envolvendo anticorpos específicos de subtipo em combinação com marcadores de proliferação exo- ou endógenos. Descrevemos aqui immunolabeling métodos para a detecção e quantificação de todas as fases da neurogénese no hipocampo adulto. Estas incluem a aplicação de análogos da timidina, perfusão transcardial, processamento de tecidos, recuperação antigênica induzida por calor, ABC imunohistoquímica, múltiplos de imunofluorescência indireta, microscopia confocal e quantificação de células. Além disso, apresentamos um protocolo de imunofluorescência sequencial de múltiplas que contorna problemas usually decorrente da necessidade do uso de anticorpos primários levantados nas mesmas espécies hospedeiras. Ele permite a identificação precisa de todos os subtipos progenitoras do hipocampo, juntamente com um marcador de proliferação dentro de uma única seção. Estas técnicas são uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação dos diferentes subtipos progenitoras em paralelo, o seu envolvimento em patologias cerebrais e o seu papel em funções específicas do cérebro.
Introduction
Duas regiões do cérebro constitutivamente gerar novos neurónios ao longo da vida, a zona subventricular dos ventrículos laterais e na zona subgranular (SGZ) do giro dentado do hipocampo (DG). Os neurônios recém-nascidos derivam de células progenitoras neurais e passam por diferentes estágios de desenvolvimento morfológico e fisiológico antes de atingirem a maturidade 1,2. A partir de uma glia-like radial células estaminais lentamente dividindo (tipo 1) estágios consecutivos de trânsito amplificando surgem células progenitoras intermediários. Os subtipos mais indiferenciadas (tipo 2A e tipo 2b) tem uma forma irregular, processos com tangenciais curtas. Geram neuroblastos (Tipo 3) que, gradualmente, sair do ciclo celular para se tornar neurónios imaturos (com dendrites estendido para a camada molecular) e, finalmente, integrar na rede de células granulares do hipocampo como maduros. Devido às suas características fisiológicas específicas dessas células fornecer o circuito com maior plasticidade 3 suggesting um papel único na função do hipocampo. Na verdade, os estudos sobre a última década gerou provas substanciais de que a neurogênese adulta contribui para a memória espacial, a separação padrão e comportamento emocional 4,5.
Neurogénese adulto pode ser estudada utilizando diferentes abordagens. Análogos da timidina incorporar em DNA durante a fase S do ciclo celular e permitir o nascimento de encontros, quantificação e análise de células de destino 6-8-nascidos. Aplicação sequencial de diferentes análogos da timidina (eg, CldU Edu ou UDI) pode ser usado para estudar a renovação celular ou populações de células nascidas em diferentes momentos durante o curso de um experimento 9. Uma alternativa, um marcador para a proliferação celular endógeno é Ki67. Ela é expressa em células em divisão, durante todas as fases do ciclo celular (G1, S, G2, H), excepto na fase de repouso (G0), e o início de G1 10,11. Para analisar o fenótipo de populações de células-nascidos no adulto dentate gyrus vários marcadores moleculares específicas de fase podem ser utilizados, tais como a GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP é um marcador de astrócitos maduros, mas também é expresso em células da glia, como radiais na parte frontal do cérebro adulto. Nestin é um filamento intermediário específico para células da glia-like radiais e as células progenitoras intermediários iniciais. DCX é uma proteína associada a microtúbulos expressa em progenitores intermediários, neuroblastos imaturos e neurónios. Com base na (co-) expressão destes três marcadores e as características morfológicas das células marcadas quatro subtipos de células progenitoras distintos podem ser identificados: o tipo 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), tipo 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) e tipo 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-rotulagem de DCX em conjunto com NeuN, que é expressa nos neurónios pós-mitóticos, permite a diferenciação de immature (DCX +, NeuN +) e maduro (DCX -, NeuN +) neurônios granulares.
Os marcadores acima mencionados são freqüentemente usados para co-rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal subseqüente ao analisar o número ea identidade das células-nascidos. Isto requer tipicamente anticorpos de diferentes espécies hospedeiras para evitar anticorpo reactividade cruzada indesejada. No entanto, a maioria dos anticorpos primários adequados para investigação neurogénese são levantados, quer em coelhos ou ratinhos (por exemplo, rato α-BrdU, rato α-NeuN, α-Ki67 de coelho, α-GFAP de coelho). Isto leva a sérias limitações no número e combinação de antígenos que possam ser avaliados em uma única fatia. Este, por sua vez, não só aumenta o esforço de coloração, como múltiplas colorações devem ser realizados, mas pode também comprometer a fiabilidade dos resultados. Além disso, alguns antigénios são susceptíveis de formalina induzida por mascaramento epitopo de fixação (por exemplo, Ki67, Nestina). Descrevemos aqui modificações dos protocolos immunolabeling simples e múltipla clássicos (por exemplo, recuperação antigênica, múltiplos immunostaining seqüencial, uso de nestin-GFP camundongos transgênicos 12) que superar muitas destas questões. Em particular, o protocolo de imunofluorescência múltipla sequencial permite coloração contra até quatro antigénios diferentes mesmo se parte dos anticorpos é derivado a partir do mesmo hospedeiro. Isto permite a detecção simultânea de tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo de células progenitoras do tipo 3, bem como a sua actividade proliferativa dentro de uma única secção.
Protocol
Representative Results
Discussion
A quantificação e identificação de subpopulações de células-nascidos é uma questão central na pesquisa neurogênese adulta. Combinando marcadores de proliferação e de anticorpos contra as proteínas expressas durante fases específicas da neurogênese adulta permite a detecção imuno-histoquímica destas subpopulações. Alguns dos anticorpos ou combinações de anticorpos específicos requerem condições de coloração.
Rotulagem de divisão de células com análogos da timidin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Riferimenti
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