एक ही मेजबान प्रजातियों से एंटीबॉडी के साथ immunohistochemistry और एकाधिक लेबल वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस अध्ययन करने के लिए
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
वयस्क neurogenesis नए न्यूरॉन्स तेजी से प्रतिबद्ध मध्यवर्ती पूर्वज उपप्रकार के माध्यम से एक सक्रिय तंत्रिका स्टेम सेल से उत्पन्न कर रहे हैं, जिसमें एक उच्च विनियमित, बहु मंच प्रक्रिया है। इन उपप्रकारों में से प्रत्येक को एक साथ, विशिष्ट रूपात्मक मापदंड के साथ उनकी पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विशिष्ट आणविक मार्कर का एक सेट व्यक्त करता है। आमतौर पर, Immunofluorescent तकनीक exo- या अंतर्जात प्रसार मार्कर के साथ संयोजन में उप-विशिष्ट एंटीबॉडी से जुड़े लागू कर रहे हैं। हम इस के साथ साथ वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के सभी चरणों का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों immunolabeling का वर्णन है। ये thymidine एनालॉग, transcardial छिड़काव, ऊतक प्रसंस्करण, गर्मी प्रेरित मिलान पुनः प्राप्ति, एबीसी immunohistochemistry, कई अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस, confocal माइक्रोस्कोपी और सेल मात्रा का ठहराव के आवेदन शामिल हैं। इसके अलावा हम समस्याओं यू के गतिरोध उत्पन्न जो एक अनुक्रमिक कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल पेशsually ही मेजबान प्रजातियों में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की जरूरत से उत्पन्न होने वाली। यह एक एकल खंड के भीतर एक प्रसार मार्कर के साथ एक साथ सभी हिप्पोकैम्पस पूर्वज उपप्रकार का एक सटीक पहचान देता है। इन तकनीकों में समानांतर में अलग पूर्वज उपप्रकार के नियमन, मस्तिष्क विकृतियों में उनकी भागीदारी और विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।
Introduction
दो मस्तिष्क क्षेत्रों अनिवार्यता से जीवन भर नए न्यूरॉन्स उत्पन्न, पार्श्व निलय की subventricular जोन और हिप्पोकैम्पस दांतेदार गाइरस (डीजी) की subgranular क्षेत्र (SGZ)। नवजात न्यूरॉन्स तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और परिपक्वता 1,2 तक पहुँचने से पहले रूपात्मक और शारीरिक विकास के विभिन्न चरणों के माध्यम से जाना। एक धीरे विभाजित रेडियल glia की तरह स्टेम सेल (टाइप 1) से पारगमन की लगातार चरणों मध्यवर्ती पूर्वज कोशिकाओं उठता amplifying। अधिक समान उपप्रकार (प्रकार 2A और टाइप 2 बी) कम है, स्पर्शरेखा प्रक्रियाओं के साथ एक अनियमित आकार है। वे (डेन्ड्राइट आणविक परत की ओर बढ़ाया) के साथ धीरे-धीरे अपरिपक्व न्यूरॉन्स बनने के लिए सेल चक्र से बाहर निकलें और अंत में हिप्पोकैम्पस नेटवर्क के रूप में परिपक्व दाना कोशिकाओं में एकीकृत कि neuroblasts (प्रकार 3) उत्पन्न करते हैं। कारण उनके विशेष शारीरिक विशेषताओं के लिए इन कोशिकाओं को बढ़ाया plasticity के तीन sugges साथ circuitry के प्रदान करते हैंting के हिप्पोकैम्पस के कार्य में एक अनूठी भूमिका। दरअसल, पिछले एक दशक के अध्ययन वयस्क न्यूरोजेनेसिस स्थानिक स्मृति, पैटर्न जुदाई और भावनात्मक व्यवहार 4,5 के लिए योगदान देता है कि पर्याप्त सबूत उत्पन्न।
वयस्क न्यूरोजेनेसिस अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। Thymidine एनालॉग सेल चक्र के एस चरण के दौरान डीएनए में शामिल करने और नवजात शिशु की कोशिकाओं को 6-8 के जन्म डेटिंग, मात्रा का ठहराव और भाग्य विश्लेषण अनुमति देते हैं। अलग thymidine एनालॉग (जैसे, CldU, edu या आईडीयू) के अनुक्रमिक आवेदन सेल कारोबार या एक प्रयोग 9 के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर पैदा हुआ सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक वैकल्पिक, सेल प्रसार के लिए अंतर्जात मार्कर Ki67 है। यह सेल चक्र (G1, एस, G2, एम) के आराम चरण को छोड़कर (G0) और G1 10,11 की शुरुआत के सभी चरणों के दौरान कोशिकाओं को विभाजित में व्यक्त किया है। वयस्क dentat में नवजात सेल आबादी के phenotype का विश्लेषण करने के लिएई गाइरस कई चरण-विशिष्ट आणविक मार्कर ऐसे GFAP, nestin, DCX और NeuN 1,6 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। GFAP परिपक्व astrocytes की एक मार्कर है, लेकिन यह भी वयस्क अग्रमस्तिष्क में रेडियल glia-तरह की कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। Nestin रेडियल glia कोशिकाओं की तरह है और जल्दी मध्यवर्ती पूर्वज कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एक मध्यवर्ती रेशा है। DCX मध्यवर्ती progenitors, neuroblasts और अपरिपक्व न्यूरॉन्स में व्यक्त एक microtubule जुड़े प्रोटीन होता है। + Nestin – प्रकार 2A (GFAP – टाइप 1 (GFAP +, nestin + DCX): इन तीन मार्करों और चार अलग पूर्वज सेल उपप्रकार पहचाना जा सकता है लेबल की कोशिकाओं के रूपात्मक सुविधाओं की (सह) अभिव्यक्ति पर आधारित , DCX -), टाइप 2 बी (GFAP – nestin + DCX +) और टाइप 3 (GFAP – nestin – DCX +) 1। एक साथ postmitotic न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, जो NeuN, साथ DCX के सह-लेबलिंग immatur के भेदभाव की अनुमति देता हैई (DCX + NeuN +) और परिपक्व (DCX – NeuN +) छोटा दाना न्यूरॉन्स।
जैसा कि ऊपर उल्लेख मार्करों अक्सर नवजात कोशिकाओं की संख्या और पहचान का विश्लेषण करने के लिए Immunofluorescent सह लेबलिंग और बाद में confocal माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किया जाता है। यह आमतौर पर अवांछित एंटीबॉडी पार जेट को रोकने के लिए विभिन्न मेजबान प्रजातियों से एंटीबॉडी की आवश्यकता है। हालांकि, न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के बहुमत या तो खरगोश या चूहों में (जैसे, माउस α-BrdU, माउस α-NeuN, खरगोश α-Ki67, खरगोश α-GFAP) उठाए गए हैं। यह एक टुकड़ा में मूल्यांकन किया जा सकता है कि एंटीजन की संख्या और संयोजन में गंभीर सीमाओं की ओर जाता है। यह बदले में कई stainings प्रदर्शन किया जा रहा है के रूप में ही नहीं, धुंधला प्रयास बढ़ जाती है, लेकिन यह भी परिणामों की विश्वसनीयता समझौता हो सकता है। इसके अलावा, कुछ एंटीजन formalin निर्धारण प्रेरित मिलान मास्किंग (जैसे, Ki67 करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, Nestin)। हम इस के साथ साथ शास्त्रीय एकल और एकाधिक immunolabeling प्रोटोकॉल से संशोधनों का वर्णन (जैसे, मिलान पुनः प्राप्ति, कई अनुक्रमिक immunostaining, nestin-GFP ट्रांसजेनिक चूहों 12 का प्रयोग) इन मुद्दों के कई दूर है। विशेष रूप से, अनुक्रमिक कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल एंटीबॉडी का हिस्सा ही मेजबान से प्राप्त होता है, भले ही अप करने के लिए चार अलग अलग एंटीजन के खिलाफ धुंधला अनुमति देता है। यह एक साथ टाइप 1, टाइप 2 ए, टाइप 2 बी और टाइप 3 पूर्वज कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, साथ ही एक एकल खंड के भीतर अपने proliferative गतिविधि में सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मात्रा का ठहराव और नवजात शिशु की कोशिकाओं के उप-जनसंख्या की पहचान वयस्क न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के क्षेत्र में एक केंद्रीय मुद्दा है। वयस्क न्यूरोजेनेसिस के विशिष्ट चरणों के दौरान व्यक्त प्रोटीन के …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Riferimenti
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