Visualisatie van<em> Streptococcus pneumoniae</em> Binnen Cardiac microverwondingen en Latere Cardiac Remodeling
Summary
Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Abstract
Tijdens bacteremia Streptococcus pneumoniae kan verplaatsen door het vasculair endotheel in het myocardium en vormen discrete bacteriën gevulde microscopische lesies (microverwondingen) die opmerkelijk zijn vanwege de afwezigheid van infiltrerende immuuncellen. Door hun vrijgave van cardiotoxische producten, S. pneumoniae binnen microverwondingen worden verondersteld bij te dragen tot het hartfalen die vaak waargenomen tijdens fulminaat invasieve pneumococcen ziekte bij volwassenen. Hierin wordt aangetoond een protocol voor experimentele muis-infectie die leidt tot cardiale microlesion vorming reproduceerbaar binnen 30 uur. Instructie wordt voorzien op microlesion identificatie in hematoxyline & eosine gekleurde hart secties en de morfologische verschillen tussen vroege en late microverwondingen worden gemarkeerd. Instructie wordt verstrekt over een protocol voor de controle van S. pneumoniae binnen microverwondingen behulp van antilichamen tegen pneumokokken capsulaire polysaccharideimmunofluorescentie microscopie. Eindelijk is een protocol voor antibiotische interventie die geïnfecteerde muizen en voor de detectie en beoordeling van littekenvorming in de harten van de herstellende muizen redt verstrekt. Samen zullen deze protocollen het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen pneumokokken cardiale invasie, cardiomyocyte dood, cardiale remodeling als gevolg van blootstelling aan S. vergemakkelijken pneumoniae en de immuunrespons op het pneumokokken in het hart.
Introduction
Hospitalisatie van volwassenen voor community-acquired pneumonie (CAP) draagt een gedocumenteerde risico op cardiale complicaties die bijdraagt aan de sterfte 1-4. In een recente studie van Corrales-Medina et al., Cardiale complicaties bleken geassocieerd te worden met en / of verantwoordelijk voor 27% van de longontsteking gepaard sterfgevallen 3. Streptococcus pneumoniae (de pneumokokken), de meest voorkomende oorzaak van het GLB en sepsis 5, is direct geassocieerd met negatieve cardiale gebeurtenissen in maar liefst 19% van de opgenomen volwassen patiënten 6. Cardiale complicaties geassocieerd met een longontsteking zijn onder andere een nieuwe of verergerde congestief hartfalen, hartritmestoornissen, en myocardinfarct in volgorde van afnemende frequentie 6.
In een recent PLoS Pathogens artikel van Brown et al., S. pneumoniae werd gevonden kunnen translocatie via cardiaal vasculair endotheel, binnenkomst in de myocardium en vorming van discrete niet-purulent microscopische lesies (microverwondingen) gevuld met bacteriën in de ventrikels gedurende invasieve pneumokokkeninfecties (IPD) 7. Bewijs van cardiale microlesion vorming werd waargenomen in cardiale monsters van niet-menselijke primaten en mensen die bezweken aan pneumokokken infectie. Ook experimenteel geïnfecteerde muizen reproduceerbaar ontwikkeld cardiale microverwondingen. In muizen, werd microlesion grootte en aantal positief gecorreleerd met de duur en ernst van bacteremie niveaus van troponine in sera en afwijkende cardiale elektrofysiologie. Bacteriële translocatie naar het hart te treden via dezelfde mechanismen die translocatie van de pneumococcus over de bloed-hersenbarrière en ontwikkeling van pneumococcen meningitis, dwz Choline-bindende eiwit A gemedieerde invasie van vasculaire endotheelcellen in een laminine receptor en bloedplaatjes -activating factor receptor afhankelijke manier 8. Microlesionenvorming vereist ook de pneumokokken porievormende toxine pneumolysine dat bleek te hartspiercellen 7 doden.
Pneumokokken cardiale microverwondingen verschillen van de purulente zachte weefsel en cardiale abcessen die worden veroorzaakt door andere Gram-positieve bacteriën zoals Staphylococcus aureus. Deze worden gekenmerkt door een enkele foci bacteriën omgeven door neutrofielen en fibrine depositie 9,10. Microverwondingen gevormd door S. pneumoniae zijn kleiner in omvang, verspreid over een getroffen hart, en missen immuun celinfiltraten. Tijdens de vroege stadia van de infectie microverwondingen veroorzaakt door S. pneumoniae verschijnen als gebieden van beschadigde of ontstoken weefsel doet denken aan de pathologische tekenen van cardiomyopathie. Sommige monocyten kunnen worden waargenomen tijdens deze periode, maar hun aanwezigheid is kortstondig en snel lesies necrotisch in verschijning en gevuld met bacteriën tegelijkertijd blijft grow in grootte tot de dood van het dier of antimicrobiële interventie. Belangrijk binnen 3 dagen na antibioticum interventie wordt overvloedig immune cel infiltratie waargenomen bij de vroegere laesie en dit gaat gepaard met sterke collageen afzetting. Soortgelijke remodellering is gemeld optreden na infarct met blijvende gevolgen op de hartfunctie 11-15. Zo microverwondingen zijn een potentiële verklaring voor de ongunstige cardiale gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de IPD en eventueel de verhoogde incidentie van cardiale-gerelateerde sterfte in herstellingsoord personen die de ziekte episode hebben overleefd.
Hierin wordt instructie die op de experimenteel muismodel van IPD en cardiale laesievorming en visualisatie van cardiale microverwondingen op vroege en late stadia van de infectie. Het protocol voor detectie van collageen in dieren die zijn opgeslagen door antimicrobiële maatregelen blijkt. Het doel van dit artikel is om facilitate het onderzoek van andere onderzoekers over dit belangrijke en nieuwe pneumokokken pathologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit verslag zeer reproduceerbare methode S. induceren pneumoniae gemedieerde cardiale microverwondingen bij muizen tijdens IPD en de technieken voor de visualisatie wordt aangetoond. Muizen geïnfecteerd met een dosis bacteriën die drempelwaarde van het immuunsysteem voor klaring overtreft, waardoor hoogwaardige bacteremie, vergelijkbaar met die welke optreedt tijdens menselijke sepsis, en leidt tot uiteindelijke bacteriële translocatie in het myocardium. Voor nog onbekende redenen, S. pneumon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
Riferimenti
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
