Visualização de<em> Streptococcus pneumoniae</em> Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente
Summary
Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Abstract
Durante a bacteremia Streptococcus pneumoniae pode translocar através do endotélio vascular para o miocárdio e formar bactérias cheios de lesões microscópicas discretas (microlesões) que são notáveis devido à ausência de infiltrado de células imunitárias. Devido a sua liberação de produtos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesões são pensados para contribuir para a insuficiência cardíaca que é freqüentemente observado durante a doença pneumocócica invasiva fulminate em adultos. Nisto é demonstrado um protocolo para a infecção experimental do rato que leva à formação reprodutíveis microlesion cardíaca dentro de 30 horas. Instrução é fornecida na identificação microlesion em hematoxilina & eosina seções coração manchado e as distinções morfológicas entre microlesões precoces e tardias são realçados. Instrução é fornecida em um protocolo de verificação de S. pneumoniae dentro microlesões usando anticorpos contra polissacarídeo capsular e pneumocócicaA microscopia de imunofluorescência. Por último, um protocolo para a intervenção antibiótico que resgata ratinhos infectados e para a detecção e avaliação da formação de cicatriz no coração dos ratos convalescentes é fornecido. Juntos, esses protocolos irá facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes invasão cardíaca pneumocócica, a morte de cardiomiócitos, remodelação cardíaca como resultado da exposição a S. pneumoniae, e a resposta imune para o pneumococos no coração.
Introduction
Internação de adultos para pneumonia adquirida na comunidade (PAC) carrega um risco documentado para eventos cardíacos adversos que contribui para a mortalidade 1-4. Em um estudo recente realizado por Corrales-Medina et al. Complicações cardíacas foram encontrados para ser associado com e / ou responsáveis por 27% dos óbitos associados à pneumonia 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococo), a causa mais comum de PAC e sepse 5, foi diretamente associada a eventos cardíacos adversos em tantos como 19% dos pacientes adultos internados 6. Eventos cardíacos adversos associados com pneumonia incluem falha nova ou agravada cardíaca congestiva, arritmias e infarto do miocárdio em ordem decrescente de freqüência de 6.
Num artigo recente PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae foi encontrado para ser capaz de translocação através do endotélio vascular cardíaca, a entrada no myocardium, e formação de lesões microscópicas não purulentos discretos (microlesões) cheios de bactérias nos ventrículos durante a doença pneumocócica invasiva (DPI) 7. Evidência de formação microlesion cardíaca foi observada em amostras cardíacas a partir de primatas não humanos e os indivíduos que tinham sucumbido à infecção pneumocócica. Da mesma forma, camundongos infectados experimentalmente reproducibly desenvolvido microlesões cardíacos. Em camundongos, o tamanho microlesion e número foi positivamente correlacionada com a duração e gravidade de bacteremia, os níveis de troponina cardíaca em soros e eletrofisiologia cardíaca aberrante. A translocação bacteriana para o coração foi observado que ocorre através dos mesmos mecanismos responsáveis pela translocação do pneumococo através da barreira sangue-cérebro e o desenvolvimento de meningite pneumocócica, ou seja, a proteína de ligação a colina A invasão mediada por células endoteliais vasculares em um receptor de laminina e Plaquetas receptor do fator de -activating forma dependente 8. Microlesformação de iões também exigiu a pneumocócica toxina pneumolisina de formação de poros que foi encontrado para matar cardiomiócitos 7.
Microlesões cardíacos pneumocócicas são distintas do soft-tecido purulenta e abcessos cardíacos que são causadas por outras bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus. Estes são caracterizados por um único focos das bactérias rodeadas por neutrófilos e a deposição de fibrina 9,10. Microle- formado por S. pneumoniae são menores em tamanho, distribuídos por todo o coração afetado, e carecem de infiltrados de células imunes. Durante as fases iniciais da infecção, microlesões causada por S. pneumoniae aparecem como áreas de tecido danificado ou inflamado reminiscente dos sinais patológicos de cardiomiopatia. Alguns monócitos podem ser observados durante este tempo, no entanto a sua presença é de curta duração e lesões rapidamente tornam-se necróticas na aparência e cheia de bactérias ao mesmo tempo continuar a GRow em tamanho até a morte do animal ou intervenção antimicrobiana. É importante salientar, no prazo de 3 dias de intervenção antibiótico, infiltração de células imunes profusa é observada no antigo local da lesão e isso é acompanhado por deposição de colágeno robusto. Remodelação cardíaca semelhante foi relatado para ocorrer após o infarto, juntamente com consequências duradouras na função cardíaca 11-15. Assim, microlesões são uma possível explicação para os eventos cardíacos adversos que ocorrem durante o IPD e, possivelmente, o aumento da incidência de mortalidade cardíaca relacionada com em indivíduos convalescentes que sobreviveram o episódio da doença.
Nisto, a instrução é fornecido no modelo experimental de rato IPD e a formação da lesão cardíaca e visualização de microlesões cardíacas em estágios precoces e tardios da infecção. O protocolo para detecção de deposição de colágeno nos animais que foram salvos pela intervenção antimicrobiana é demonstrada. O objetivo deste artigo é o de facilitate a pesquisa de outros pesquisadores sobre esta patologia pneumocócica importante e romance.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório, um método altamente reprodutível para induzir S. pneumoniae mediada microlesões cardíacos em ratos durante IPD e as técnicas para a sua visualização é demonstrada. Os ratinhos são infectados com uma dose de bactérias que ultrapassa o limiar do sistema imunitário para a depuração, que conduz a bacteremia de alto grau, semelhante ao que ocorre durante a sepsia humano, e leva a uma eventual translocação bacteriana no miocárdio. Por razões ainda desconhecidas, S. pneumoniae</e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
Riferimenti
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