Visualisering av<em> Streptococcus pneumoniae</em> Innen Hjerte Microlesions og Følgende Cardiac Remo

Summary

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Abstract

Under bakteriemi Streptococcus pneumoniae kan translocate over det vaskulære endotelet til hjertemuskelen og danne diskrete bakterie fylt mikroskopiske lesjoner (microlesions) som er bemerkelsesverdig på grunn av fravær av infiltrerende immunceller. På grunn av sin utgivelse av kardio produkter, S. pneumoniae innen microlesions er tenkt å bidra til hjertesvikt som ofte observert under fulminate invasiv pneumokokksykdom hos voksne. Heri er vist en protokoll for eksperimentell muse infeksjon som fører til en reproduserbar hjerte mikrolesjon dannelse i løpet av 30 timer. Undervisningen gis på mikrolesjon identifikasjon i hematoxylin og eosin farget hjerte seksjoner og de morfologiske forskjeller mellom tidlige og sene microlesions er uthevet. Undervisningen gis på en protokoll for verifikasjon av S. pneumoniae innen microlesions bruker antistoffer mot pneumokokk kapselpolysakkarid ogimmunofluorescent mikroskopi. Siste, er en protokoll for antibiotika intervensjon som redder infiserte mus og for påvisning og vurdering av arrdannelse i hjertene til rekonvalesent mus gitt. Sammen vil disse protokollene lette etterforskningen av de molekylære mekanismene bak pneumokokk hjerte invasjon, cardiomyocyte død, hjertestans ombygging som følge av eksponering for S. pneumoniae, og immunrespons mot pneumokokker i hjertet.

Introduction

Innleggelse av voksne for smittsom lungebetennelse (CAP) bærer en dokumentert risiko for uheldige kardiale hendelser som bidrar til dødelighet ^1-4. I en fersk undersøkelse utført av Corrales-Medina et al. Hjertekomplikasjoner ble funnet å være assosiert med og / eller ansvarlig for 27% av lungebetennelse assosierte dødsfall ^tre. Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus), den vanligste årsaken til CAP og sepsis ^5, har vært direkte forbundet med negative kardiale hendelser i så mange som 19% av innlagte voksne pasienter ^6. Alvorlige hjerte hendelser assosiert med lungebetennelse inkluderer ny eller forverret hjertesvikt, arytmier, og hjerteinfarkt etter synkende frekvens ^6.

I en nylig PLoS Patogener artikkel av Brown et al., S. pneumoniae ble funnet å være i stand til å translokasjon gjennom hjerte vaskulært endotel, inntreden i myocardium, og dannelse av diskrete ikke-purulent mikroskopiske lesjoner (microlesions) fylt med bakterier i ventriklene i løpet av invasiv pneumokokksykdom (IPD) ^7. Bevis på hjerte mikrolesjon dannelse ble observert i hjerteprøver fra ikke-menneskelige primater og enkeltpersoner som hadde bukket under for pneumokokkinfeksjon. Likeledes, eksperimentelt infiserte mus reproduserbart utviklet hjerte microlesions. Hos mus ble mikrolesjon størrelse og antall positivt korrelert med varigheten og alvorlighetsgraden av bakteriemi, nivåer av hjerte troponin i sera, og avvikende hjerteelektrofysiologi. Bakteriell translokasjon inn i hjertet ble funnet å skje gjennom de samme mekanismer som er ansvarlig for translokasjon av pneumococcus over blod-hjernebarrieren og utvikling av pneumokokk meningitt, dvs. choline-bindende protein A-mediert invasjon av vaskulære endotelceller i et Laminin reseptor og blodplater -aktiverende faktor reseptor avhengig måte ^8. Microlesion formasjon også nødvendig pneumokokk poredannende toksin pneumolysin som ble funnet å drepe kardiomyocytter ^7.

Pneumokokkhjerte microlesions er forskjellig fra purulent bløtvevet og hjerte abscesser som er forårsaket av andre Gram-positive bakterier inkludert Staphylococcus aureus. Disse er karakterisert ved en enkelt foci av bakterier omgitt av neutrofiler og fibrinavsetning ^9,10. Microlesions dannet av S. pneumoniae er mindre i størrelse, fordelt over et berørt hjerte, og mangler immun celleinfiltrater. Under de tidlige stadier av infeksjon, microlesions forårsaket av S. pneumoniae vises som områder av skadet eller betent vev som minner om de patologiske tegn på kardiomyopati. Noen monocytter kan observeres i løpet av denne tiden, men deres tilstedeværelse er kortvarig og lesjoner raskt bli nekrotisk i utseende og fylt med bakterier samtidig fortsetter å grow i størrelse inntil døden av dyr eller antimikrobielle intervensjon. Viktigere, innen 3 dager etter antibiotika intervensjon, er rikelig immuncelleinfiltrasjon observert ved tidligere lesjon området og dette er ledsaget av robust kollagen deponering. Lignende hjerte ombygging har blitt rapportert å forekomme etter infarkt sammen med varige konsekvenser på hjertefunksjon ^11-15. Dermed microlesions er en potensiell forklaring på de negative kardiale hendelser som oppstår under IPD og muligens økt forekomst av hjerterelatert dødelighet i rekonvalesent personer som har overlevd sykdommen episoden.

Her, er undervisning gitt på den eksperimentelle musemodell for IPD og hjerteskade dannelse og visualisering av hjerte microlesions på tidlige og sene stadier av infeksjon. Protokollen for påvisning av kollagen deponering i dyr som har blitt reddet av antimikrobielle intervensjon blir demonstrert. Målet med denne artikkelen er å facilitate forskning av andre forskere på dette viktige og romanen pneumokokk patologi.

Protocol

MERK: Alle mus eksperimenter ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komiteer ved The University of Texas Health Science Center på San Antonio (protokoll # 13032-34-01C). Dyr omsorg og eksperimentelle protokoller følges offentlig rett 89-544 (dyrevernloven) med endringer, offentlige helsetjenester retningslinjer, og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (US Department of Health & Human Services). 1. Infeksjon Skaff BALB / c mus av begge kjønn i a…

Representative Results

Visualisering av Microlesions av H & E Hjerte microlesions ble observert i ventriklene av H & E farget hjerte seksjoner fra mus med IPD følgende deres ip utfordring med TIGR4. Figur 1 viser økningen i størrelsen på disse lesjoner mellom 24 og 30 timer etter infeksjon (HPI), med større antall hematoxylin -stained (dvs. lilla-blå) pneumokokker synlig i lesjonen. Microlesions ble karakterisert ved en vakuole-lignende morfologi, tettere eosin (rø…

Discussion

I denne rapporten, til en svært reproduserbar metode indusere S. pneumoniae -mediert hjerte microlesions hos mus i løpet av IPD og teknikker for deres visualisering er demonstrert. Musene infiseres med en dose av bakterier som overgår immunsystemets terskel for klaring, som fører til høy grad av bakteremi, lik det som forekommer i løpet av human sepsis, og fører til slutt bakteriell translokasjon inn i hjertemuskelen. For ennå ukjente grunner, S. pneumoniae i hjertet er i stand til å gjenskape…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Todd-Hewitt broth	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum	Statens Serum Institut	16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
phosphomolybdic acid 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0.01 N hydrochloric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscope Slides	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	unspeciified		Standard