Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Under bakteriemi Streptococcus pneumoniae kan translocate over det vaskulære endotelet til hjertemuskelen og danne diskrete bakterie fylt mikroskopiske lesjoner (microlesions) som er bemerkelsesverdig på grunn av fravær av infiltrerende immunceller. På grunn av sin utgivelse av kardio produkter, S. pneumoniae innen microlesions er tenkt å bidra til hjertesvikt som ofte observert under fulminate invasiv pneumokokksykdom hos voksne. Heri er vist en protokoll for eksperimentell muse infeksjon som fører til en reproduserbar hjerte mikrolesjon dannelse i løpet av 30 timer. Undervisningen gis på mikrolesjon identifikasjon i hematoxylin og eosin farget hjerte seksjoner og de morfologiske forskjeller mellom tidlige og sene microlesions er uthevet. Undervisningen gis på en protokoll for verifikasjon av S. pneumoniae innen microlesions bruker antistoffer mot pneumokokk kapselpolysakkarid ogimmunofluorescent mikroskopi. Siste, er en protokoll for antibiotika intervensjon som redder infiserte mus og for påvisning og vurdering av arrdannelse i hjertene til rekonvalesent mus gitt. Sammen vil disse protokollene lette etterforskningen av de molekylære mekanismene bak pneumokokk hjerte invasjon, cardiomyocyte død, hjertestans ombygging som følge av eksponering for S. pneumoniae, og immunrespons mot pneumokokker i hjertet.
Innleggelse av voksne for smittsom lungebetennelse (CAP) bærer en dokumentert risiko for uheldige kardiale hendelser som bidrar til dødelighet 1-4. I en fersk undersøkelse utført av Corrales-Medina et al. Hjertekomplikasjoner ble funnet å være assosiert med og / eller ansvarlig for 27% av lungebetennelse assosierte dødsfall tre. Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus), den vanligste årsaken til CAP og sepsis 5, har vært direkte forbundet med negative kardiale hendelser i så mange som 19% av innlagte voksne pasienter 6. Alvorlige hjerte hendelser assosiert med lungebetennelse inkluderer ny eller forverret hjertesvikt, arytmier, og hjerteinfarkt etter synkende frekvens 6.
I en nylig PLoS Patogener artikkel av Brown et al., S. pneumoniae ble funnet å være i stand til å translokasjon gjennom hjerte vaskulært endotel, inntreden i myocardium, og dannelse av diskrete ikke-purulent mikroskopiske lesjoner (microlesions) fylt med bakterier i ventriklene i løpet av invasiv pneumokokksykdom (IPD) 7. Bevis på hjerte mikrolesjon dannelse ble observert i hjerteprøver fra ikke-menneskelige primater og enkeltpersoner som hadde bukket under for pneumokokkinfeksjon. Likeledes, eksperimentelt infiserte mus reproduserbart utviklet hjerte microlesions. Hos mus ble mikrolesjon størrelse og antall positivt korrelert med varigheten og alvorlighetsgraden av bakteriemi, nivåer av hjerte troponin i sera, og avvikende hjerteelektrofysiologi. Bakteriell translokasjon inn i hjertet ble funnet å skje gjennom de samme mekanismer som er ansvarlig for translokasjon av pneumococcus over blod-hjernebarrieren og utvikling av pneumokokk meningitt, dvs. choline-bindende protein A-mediert invasjon av vaskulære endotelceller i et Laminin reseptor og blodplater -aktiverende faktor reseptor avhengig måte 8. Microlesion formasjon også nødvendig pneumokokk poredannende toksin pneumolysin som ble funnet å drepe kardiomyocytter 7.
Pneumokokkhjerte microlesions er forskjellig fra purulent bløtvevet og hjerte abscesser som er forårsaket av andre Gram-positive bakterier inkludert Staphylococcus aureus. Disse er karakterisert ved en enkelt foci av bakterier omgitt av neutrofiler og fibrinavsetning 9,10. Microlesions dannet av S. pneumoniae er mindre i størrelse, fordelt over et berørt hjerte, og mangler immun celleinfiltrater. Under de tidlige stadier av infeksjon, microlesions forårsaket av S. pneumoniae vises som områder av skadet eller betent vev som minner om de patologiske tegn på kardiomyopati. Noen monocytter kan observeres i løpet av denne tiden, men deres tilstedeværelse er kortvarig og lesjoner raskt bli nekrotisk i utseende og fylt med bakterier samtidig fortsetter å grow i størrelse inntil døden av dyr eller antimikrobielle intervensjon. Viktigere, innen 3 dager etter antibiotika intervensjon, er rikelig immuncelleinfiltrasjon observert ved tidligere lesjon området og dette er ledsaget av robust kollagen deponering. Lignende hjerte ombygging har blitt rapportert å forekomme etter infarkt sammen med varige konsekvenser på hjertefunksjon 11-15. Dermed microlesions er en potensiell forklaring på de negative kardiale hendelser som oppstår under IPD og muligens økt forekomst av hjerterelatert dødelighet i rekonvalesent personer som har overlevd sykdommen episoden.
Her, er undervisning gitt på den eksperimentelle musemodell for IPD og hjerteskade dannelse og visualisering av hjerte microlesions på tidlige og sene stadier av infeksjon. Protokollen for påvisning av kollagen deponering i dyr som har blitt reddet av antimikrobielle intervensjon blir demonstrert. Målet med denne artikkelen er å facilitate forskning av andre forskere på dette viktige og romanen pneumokokk patologi.
I denne rapporten, til en svært reproduserbar metode indusere S. pneumoniae -mediert hjerte microlesions hos mus i løpet av IPD og teknikker for deres visualisering er demonstrert. Musene infiseres med en dose av bakterier som overgår immunsystemets terskel for klaring, som fører til høy grad av bakteremi, lik det som forekommer i løpet av human sepsis, og fører til slutt bakteriell translokasjon inn i hjertemuskelen. For ennå ukjente grunner, S. pneumoniae i hjertet er i stand til å gjenskape…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Fluorsave | Millipore | 345789 | |
Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
Ampicillin | Sigma | A9393 | |
phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |